随着鱼类作为食品原料越来越广泛的应用到食品工业中，鱼类过敏的发病率逐年提高，这一方面要求对食品中的鱼类过敏原进行严格的检测，另一方面需要提高鱼类过敏的诊断效果。世界很多国家都对食品中鱼类过敏原进行检测，主要采用酶联免疫的方法，由于鱼类地域性差异及国际贸易日渐扩大等问题，针对我国的对鱼类过敏原特性的研究无论是对食品工业中鱼类过敏原的检测，还是对医疗领域鱼类过敏的诊断都具有重要的意义。本研究针对我国养殖和消费量比较大的大菱鲆(Scophthalmus maximus)，根据过敏原的已知特性对天然过敏原进行提取和纯化，由于抽提所得蛋白在冷冻储藏期间其含量和活性均出现不同程度的降低，从而探讨了过敏原在储藏过程中的蛋白质氧化对过敏原活性的影响。鉴于天然过敏原存在不稳定、量小难以控制等问题，考虑利用基因工程技术对大菱鲆过敏原进行分子克隆，制备重组的小清蛋白，来获取稳定的、安全的、重现性好的鱼类过敏原。主要结果如下：1.建立规范的大菱鲆过敏原抽提方法大菱鲆过敏原小清蛋白是典型的酸性小分子蛋白质，三个亚基之间会形成的聚集体，采用12种提取液对大菱鲆蛋白进行抽提，通过对其IgE结合能力进行检测能够获得较好的蛋白质抽提方法。加入DTT后，Tris，Glycine提取液抽提的蛋白质的含量增加13.46%，IgG结合能力提高6.22%，并利用免疫印迹等进行检测，结果显示Tris、Glycine和DTT提取液抽提的16ku，36ku，41ku和46ku的蛋白能够与3位过敏患者的血清发生强烈的免疫反应。和未加入DTT的同一种提取液相比，加入DTT的提取液获得的蛋白的含量和活性较高。加入DTT的Tris，Glycine提取液获得的蛋白浓度最高为4.51mg/mL；与过敏患者的血清结合能力比其他提取方法高。因此加入DTT的Tris，Glycine提取液可以用于大菱鲆过敏原的抽提。建立标准化的过敏原提取程序对临床诊断和治疗是非常必要的，本研究旨在建立标准化的鱼类过敏原的提取系统。2.探讨氧化作用对大菱鲆过敏原蛋白的影响为了探明蛋白质储藏过程中蛋白含量及活性的变化规律，本文以大菱鲆为研究对象，采用羟基自由基氧化体系对大菱鲆过敏原进行不同程度的氧化，检测其功能基团的变化规律，并分别利用鱼类过敏患者血清和兔抗大菱鲆小清蛋白多克隆抗体分析大菱鲆过敏原小清蛋白免疫功能的变化规律。结果表明：大菱鲆蛋白经过5h氧化，27%的蛋白质发生了沉淀。另外，氧化5h后上清液中和沉淀中的蛋白的羰基含量分别增加了9.7倍和2.0倍，上清液中和沉淀中蛋白的巯基含量分别降低了13.5%和29.1%。与对照组相比，实验组中的12ku、26ku和41ku处蛋白的含量减少，然而沉淀中36ku左右的蛋白含量随着氧化时间的增长而增加，可能是小分子蛋白聚集的结果。免疫印迹结果显示实验组蛋白与鱼类过敏的患者血清之间的特异性反应强度降低。ELISA结果表明经过5h氧化处理后上清液中和沉淀中大菱鲆过敏原的活性分别降低了16.7%和31.5%。以上实验数据说明氧化改变了大菱鲆蛋白的理化性质，并可能改变了大菱鲆蛋白的结构，进而影响了大菱鲆过敏原蛋白的功能性质。3.重组蛋白的表达，鉴定及纯化利用分子克隆技术对大菱鲆小清蛋白进行重组表达，并对重组蛋白的结构和免疫学性质进行研究，进而将其结构和免疫活性与天然蛋白进行比较。实验通过SDS-PAGE分析诱导表达前后菌体蛋白组成，结果表明表达后的电泳图谱比表达前多出一条带（分子量约15ku），大肠杆菌成功表达出重组蛋白。在免疫印迹实验中，发现此蛋白可以与兔抗大菱鲆小清蛋白抗体发生免疫反应；ELISA结果也表明该重组蛋白的免疫原活性是天然蛋白免疫活性的85.76%。结果显示：所用的重组大肠杆菌菌株可成功表达出大菱鲆重组蛋白，可初步判定此蛋白为重组大菱鲆小清蛋白，且该蛋白具有较高的免疫原活性。利用差示扫描量热法测定纯化的重组蛋白的热稳定性，发现重组蛋白的吸热峰峰值温度为77.73℃，具有良好的热稳定性。