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第一部分Nogo-A短发夹样RNA真核表达载体的构建目的构建靶向Nogo-A基因的短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体。方法根据Gene bank中提供的Nogo-A基因核苷酸序列,设计并化学合成2条shRNA,退火后克隆到pGenesil-1质粒的U6启动子下游从而构建重组载体,行限制性内切酶酶切和基因测序进行鉴定。结果序列分析结果表明,两个重组质粒的shRNA编码序列均成功插入到预定位置。结论成功构建靶向Nogo-A的shRNA真核表达载体,为进一步研究Nogo-A蛋白的功能及轴突再生抑制的基因治疗提供了新的方法。第二部分短发夹样RNA抑制PC12细胞Nogo-A基因表达的研究目的研究Nogo-A shRNA对PC12细胞Nogo-A基因表达的抑制作用,为下一步探索Nogo-A的功能奠定基础。方法经脂质体2000将前期构建的两个pGenesil-1/Nogo-A shRNA质粒转染PC12细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察EGFP的表达,分别于转染后48h后应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测Nogo-A mRNA及蛋白表达水平。结果与对照组相比,空载体组的Nogo-A mRNA及蛋白表达水平无显着性差异(p>0.05),而转染pGenesil-1-/Nogo-A组的Nogo-A mRNA及蛋白表达水平均明显下降(p<0.05)。结论构建的pGenesil-1-/Nogo-A shRNA重组质粒能有效抑制Nogo-A基因在PC12细胞的表达。第三部分RNA干扰抑制Nogo-A基因表达对PC12细胞多巴胺释放的影响目的研究抑制Nogo-A基因表达对PC12细胞多巴胺释放的影响,探讨Nogo-A在神经内分泌细胞表达的意义。方法经脂质体将Nogo-A shRNA真核表达质粒转染到PC12细胞,分别于转染后24h、48h采用高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography, HPLC)检测不同处理组细胞的多巴胺释放量。结果与对照组相比,转染48h后Nogo-A shRNA组细胞多巴胺释放量明显减少(P<0.05),而转染空载体组多巴胺释放量无明显变化(P>0.05)。结论Nogo-A基因沉默可以抑制PC12细胞多巴胺的释放,Nogo-A可能参与多巴胺的释放调节。第四部分RNA干扰抑制Nogo-A基因表达对PC12细胞凋亡的影响目的研究Nogo-A基因沉默对PC12细胞凋亡的影响。方法应用脂质体将Nogo-A shRNA真核表达载体转染到PC12细胞,在转染后不同时间应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖活性,原位末端标记(TUNEL)法及流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果与对照组相比,Nogo-A siRNA处理组细胞的增殖活性明显增加(P<0.05),凋亡率明显下降(P<0.05)。结论Nogo-A基因可能与肿瘤细胞凋亡有关。