卫气是行于脉外而具有保卫作用的气,是人体之气的重要组成部分。《灵枢·本藏》云:“卫气者,所以温分肉,充皮肤,肥腠理,司开阖者也。”即是对卫气防御外邪、温养全身、调节排汗等三方面功能的概括。随着科学技术的进步,学者们对于卫气实质的研究主要涉及到了免疫、热代谢等方面,这些研究多着眼于卫气的单一功能,偏离了中医的整体观念和《黄帝内经》卫气理论的原意。代谢组学(metabolomics)是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后兴起的系统生物学的新分支。它通过考察生物体系受刺激或扰动前后代谢产物图谱及其动态变化来研究生物体系的代谢网络。它跳过了生命体内复杂的调控过程,通过对代谢物的分析给出最终的、整体的结果,这种在整体上展示生物体内在的动态变化状况的技术,避免了以往采用单一或少数几个指标研究某种生理和病理变化的弊端,故而在方法学上具有融整体、动态、综合、分析于一体的特点,符合中医学整体性的原则,是一项比较适合中医学研究的技术手段。节律性是卫气运行的重要特征。目前,对于卫气节律的现代医学研究多集中在年节律和日节律,月节律研究相对较少。但是,早在2000多年前的《黄帝内经》中就提及了卫气的月节律,如《素问·八正神明论》云:“月始生,则血气始精,卫气始行,月廓满,则血气实,肌肉坚,月廓空,则肌肉减,经络虚,卫气去,形独居。”阐明了卫气的月节律变化。现代医学研究发现:生物节律大都由体内的生物钟调控。生物钟有其自身调控反馈环路。在哺乳动物体内,生物钟的调控与若干钟基因、钟相关基因和钟控基因及其蛋白产物通过转录-翻译-翻译后事件的相互衔接有关。一个钟基因的突变,就可导致节律的紊乱。因此,观察钟基因及其转录、翻译水平的改变,是研究生物节律调节机制的最直接方法。我们课题组曾以寒热刺激法复制大鼠卫气虚证模型,并以正常大鼠血清为研究对象,进行卫气月生理节律的代谢组学研究。在前期的实验研究基础之上,我们首次对卫气虚证的造模方法进行了改良,以疲劳联合寒热交替法制作大鼠卫气虚证模型;选取月初、月中、月末3个时间,对正常及卫气虚证大鼠的中枢免疫器官—胸腺进行代谢组学检测,并对正常大鼠外周血淋巴细胞、胸腺细胞进行生物钟相关基因测定。这样从“小分子代谢物水平”和“生物钟基因表达水平”等两端入手研究卫气月节律,以推测两者之间生命体内复杂的调控过程。本篇论文主要包括理论和实验两大部分。第一部分卫气月节律理论探讨目的:从古今文献中发掘卫气的月节律理论、节律机制,并探讨利用新技术平台对卫气月节律展开深入、全面探索的可行性。方法:从生物节律的基因调节机制、卫气节律的中西医研究现状(重点是月节律)、以代谢组学和生物钟基因共同研究卫气月节律的可行性探讨等角度进行了详细论述。结论:目前关于卫气免疫的研究多着眼于某个或某几个免疫指标上,缺乏整体研究。另外,关于卫气免疫节律的研究,较多的为年节律和日节律,月节律较少涉及。而以具有“整体性”和“动态性”特点的代谢组学技术和从基因水平上来共同研究卫气的月节律,意义重大。第二部分卫气月节律的实验研究实验一卫气虚证大鼠模型的建立及玉屏风散的反证效果研究目的:探索卫气虚证动物模型的建立方法并观察玉屏风散对模型的反证效果。方法:将SD大鼠以疲劳联合寒热交替法制作大鼠卫气虚证模型,并与正常对照组、环磷酰胺组、寒热刺激组及中药干预组对比,观察其在大鼠行为学、体重、胸腺指数、脾脏指数、脾脏细胞因子含量等指标的变化,以评价疲劳联合寒热交替法制作卫气虚证模型的科学性与合理性。结果:通过对各组大鼠行为学观察发现,疲劳寒热组的造模方法更接近中医卫气虚证的宏观评定标准。通过对各组大鼠体重、胸腺指数、脾脏指数、脾脏细胞因子含量等指标的统计学分析发现:与正常对照组比较,疲劳寒热组上述指标均显著下降(P<0.05﹚;与环磷酰胺组比较,上述指标无显著差异(P>0.05﹚;与寒热刺激组比较,上述指标均显著下降(P<0.05﹚;中药干预组较疲劳寒热组各项指标显著升高(P<0.05﹚。结论:疲劳联合寒热交替法造模是较为理想的中医卫气虚证大鼠模型造模方法。实验二基于胸腺代谢组学的卫气月生理节律研究目的:通过代谢组学技术,寻找在胸腺这一局部微环境下体现卫气月生理节律变化的小分子标志化合物。方法:以秋分日所在农历月,确定分月初组、月中组和月末组。分别在农历2013年八月初一、八月十五、八月三十正午12:00选择正常SD大鼠10只,取胸腺组织,进行代谢组学检测,得到代谢谱数据后,采用SIMCA-P软件对各组数据进行主成分分析(PCA)及偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)等,并确定潜在标志物。结果:(1)从三组的PCA图及月中组与月初组、月中组与月末组的PLS-DA图上看,月中组与月初组、月末组明显分类,说明其代谢成分与另两组有区别。(2)硫胺、鸟苷、皮质醇呈现月初、月末低,月中高的趋势,符合卫气月中强、月初月末弱的变化规律。结论:正常SD大鼠卫气存在月节律变化,硫胺、鸟苷、皮质醇可能是参与或调节卫气月节律的潜在生物标志物。实验三基于胸腺代谢组学的卫气虚证月节律研究目的:通过代谢组学技术,寻找在胸腺这一局部微环境下,卫气虚证的小分子标志化合物,以及伴随卫气虚证月节律波动的小分子标志化合物。方法:实验分月初、月中、月末三个时间进行。每次实验开始之前,将30只SD大鼠以随机数字表法分为对照组、模型组和治疗组,每组10只。对照组:常规饲养。模型组:给予疲劳联合寒热交替法造模。治疗组:造模同疲劳寒热组,每日造模后灌服玉屏风散中药配方颗粒剂。采用液相色谱-质谱联用仪,对大鼠胸腺组织进行代谢物检测,得到代谢谱数据后,采用SIMCA-P软件对各时间的分组数据进行主成分、偏最小二乘法等分析,并确定潜在标志物。结果:(1)从月初、月中、月末3个时间的3组PCA图上看,模型组与对照组的代谢谱均明显不同,均可以明显分类。治疗组与对照组分类不完全,部分融合在一起。(2)月初、月中、月末3个时间存在不完全相同的卫气虚证的潜在标志物。(3)皮质醇、环腺苷酸伴随卫气虚证一月之中均出现,呈现月中高,月初、月末低的规律。结论:卫气虚证SD大鼠卫气存在月节律变化,皮质醇、环腺苷酸可能是伴随卫气虚证月节律的潜在标志物。实验四正常大鼠外周血淋巴细胞、胸腺细胞生物钟基因Clock、Bmal、Per1表达的月节律变化目的:观察正常大鼠外周血淋巴细胞、胸腺细胞生物钟基因Clock、Bmal、Per1表达的月节律变化方法:以秋分日所在农历月,确定分月初组、月中组和月末组。分别在农历2013年八月初一、八月十五、八月三十正午12:00选择正常SD大鼠10只,断头取血及胸腺组织,并以RT-PCR技术检测三组大鼠外周血淋巴细胞、胸腺细胞生物钟基因Clock、Bmal、Per1 m RNA表达的变化。结果:外周血淋巴细胞、胸腺细胞中Clock、Bmal、Per1基因m RNA的表达,月中组明显高于月初组、月末组(P<0.05),而月末组与月初组比较差异无统计学意义(P>0.05﹚。结论:生物钟基因Clock、Bmal、Per1表达的月周期变化规律与卫气的月周期变化具有一致性,可能是卫气月周期变化的重要分子生物学基础。