论文部分内容阅读
背景弥漫性肺泡出血（diffuse alveolar hemorrhage,DAH）是一种以咯血、缺铁性贫血和弥漫性肺泡浸润为特征的临床综合征,多种自身免疫性疾病均可引起DAH,系统性红斑狼疮（systematic lupus erythematosus,SLE）引起的DAH的占多数。DAH发病率较低,但病死率较高,为50%～70%。DAH在临床中常用皮质类固醇激素联合免疫抑制剂治疗,缺乏特异性治疗方案,危重症常需联合血浆置换疗法,通常治疗效果不佳,因此,找到有效的DAH治疗方法是非常必要的。依托泊苷（etoposide,ET）是一种作用于DNA拓扑异构酶Ⅱ的抗肿瘤药物,临床多用于治疗淋巴瘤和嗜血综合征,药物毒性低,安全性较高。另外,依托泊苷可用于治疗巨噬细胞异常激活的疾病,例如巨噬细胞活化综合征（macrophage activation syndrome,MAS）,ET治疗MAS时,常被当做免疫抑制剂使用,ET可通过减少肺部的TNF-α,消除活化的巨噬细胞和NKT细胞来减轻细胞损伤,并显著提高相关模型的存活率。据现有研究表明,巨噬细胞在DAH的发病过程中起重要作用。然而,却少有研究关注ET在DAH中的治疗作用。本研究通过采用Pristane诱导C57BL/6小鼠发生SLE-DAH模型,此模型中肺毛细血管炎症在病理表现上与人SLE相关的DAH相似。本研究通过动物实验和分子实验来探讨DAH的发病机制和ET对DAH小鼠的治疗作用及相关作用机制。目的通过构建DAH小鼠模型（腹腔单次注射Pristane）,探究ET在DAH小鼠模型中的治疗效果及其可能作用机制,并探索对DAH小鼠模型的最佳治疗方案。方法1、ET对DAH小鼠的干预效果。（1）ET全程干预对DAH小鼠肺部出血改善的研究。24只雌性C57BL/6小鼠被随机分为对照组、DAH模型组和ET治疗组各8只。实验开始当天,DAH模型组和ET治疗组小鼠一次性腹腔注射0.5 ml Pristane,对照组注射等量PBS,ET治疗组小鼠腹腔注射ET（10mg/kg/d）,连续14天。在第15天解剖小鼠,肉眼观察肺组织出血情况,HE染色病理分析肺组织病理变化。（2）不同浓度ET治疗方案对小鼠DAH发生率的影响。将40只雌性C57BL/6 小鼠随机分为 3.3mg/kg组、2.5mg/kg组、1.7mg/kg组和 1.0mg/kg组各10只,实验开始当天,4组小鼠单次腹腔注射0.5 ml Pristane。3.3mg/kg组腹腔注射ET 3.3mg/kg,每天1次,2.5mg/kg组腹腔注射ET 2.5mg/kg,每天1次;1.7mg/kg组腹腔注射ET 1.7mg/kg,每天 1 次;1.0mg/kg组腹腔注射ET 1.0mg/kg,每天1次。在第14天解剖小鼠,肉眼观察肺组织出血情况,HE染色病理分析肺组织病理变化;（3）不同治疗方案对小鼠DAH发生率的影响。将40只雌性C57BL/6小鼠随机分为5组:DAH模型组,ET治疗组,EPO治疗组,联合给药组,对照组。除对照组外,其他四组小鼠腹腔注射0.5ml pristane后,ET治疗组第1天到第14天持续腹腔注射ET（1.7mg/kg）;EPO治疗组第1天到第14天持续腹腔注射EPO（1000U/kg）;联合给药组每天腹腔注射ET（1.7mg/kg）和EPO（1000U/kg）,持续14天。对照组腹腔注射生理盐水0.5ml,每天注射等体积PBS。14天后观察不同给药组对DAH的治疗效果并进行病理分析。（4）ET全程治疗对DAH小鼠死亡率的影响。将40只雌性C57BL/6小鼠随机分为ET治疗组,和DAH模型组各20只,ET治疗组和DAH模型组实验开始当天,一次性腹腔注射0.5 ml Pristane构建DAH模型,ET治疗组从第1天到第1 4天腹腔注射ET（10mg/kg）,连续14天;DAH模型组每天腹腔注射等体积PBS。观察30天,统计两组小鼠的死亡情况并分析生存率。2、ET对SLE-DAH模型的可能作用机制研究。（1）ET对SLE-DAH小鼠中炎性细胞与炎性因子的影响。实验方法同1（1）,在第14天解剖小鼠,肉眼观察肺组织出血情况,HE染色病理分析肺组织病理变化,QPCR法检测肺组织中IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ的表达水平,酶联免疫吸附法检测BALF中的IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ的表达水平,免疫荧光染色法检测肺组织中巨噬细胞（F4/80标记）和中性粒细胞（Ly6G标记）的数量,M1型巨噬细胞（iNOS标记）和M2型巨噬细胞（CD163标记）的数量。（2）ET对SLE-DAH小鼠中凋亡蛋白的影响,实验方法同1（1）,在第14天解剖小鼠,肉眼观察肺组织出血情况,HE染色病理分析肺组织病理变化,TUNEL染色检测凋亡细胞数量,Western blot法检测Bcl-2、Bax和caspase-3的蛋白表达水平。结果1、（1）ET治疗组和对照组肺组织呈正常粉红色,未见出血,组织病理示肺组织正常,未见炎症细胞浸润,DAH模型组肺组织呈暗红色,可见弥漫性出血,组织病理示肺泡腔内充满大量的红细胞并伴有炎症细胞浸润。（2）ET的治疗效果与剂量多少有关,在设置的浓度梯度中,3.3mg/kg组治疗效果最好。（3）以ET为中心的联合治疗方案ET联合EPO组治疗效果最好。（4）ET治疗组相比于DAH模型组,DAH小鼠的生存率明显提高。.2、与对照组相比,DAH模型组免疫荧光染色显示,巨噬细胞（F4/80标记）和中性粒细胞（Ly6G标记）均明显增多,与DAH模型组相比,ET治疗组巨噬细胞（F4/80标记）和中性粒细胞（Ly6G标记）均明显减少;ET治疗组促炎因子（IL-6、TNF-α、IFN-γ）和M1型巨噬细胞（iNOS标记）均显著减少,抗炎因子（IL-10）和M2型巨噬细胞（CD163标记）变化不明显;3、3组小鼠肺细胞凋亡Tunel染色结果显示DAH模型组小鼠凋亡细胞明显高于对照组与ET治疗组。3组小鼠肺细胞凋亡率比较差异有统计学意义。ET治疗组与模型组相比TUNEL染色阳性细胞、促凋亡蛋白Bax均显著减少,而抗凋亡蛋白Bcl-2显著增加,凋亡蛋白caspase-3显著减少。DAH模型组与对照组相比TUNEL染色阳性细胞、促凋亡蛋白Bax均显著增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2显著减少,凋亡蛋白caspase-3显著增加。结论1、ET对Pristane诱导的DAH小鼠模型有明显的治疗作用。2、ET可能通过调节线粒体途径抑制细胞凋亡,减少促炎细胞的募集发挥治疗作用。