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药物、毒物、致癌物等外来物质(xenobiotic)在体内一般经历两相代谢过程。一相代谢过程(phase 1)主要是在P450酶系的参与下,对外来物质进行氧化、还原、羟化等,使其大部分失活;二相代谢过程(phase 2)主要是在一些酶的催化下,将内源性极性小分子物质如葡萄糖醛酸、谷胱甘肽(GSH)等,经共价键结合到外来物质或一相代谢活化物的分子上,使其失活、解毒。因此将参与二相代谢过程的酶统称为药物代谢二相酶(phase 2 enzymes),如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)、环氧化物水解酶(EH)、血红素加氧酶(HO-1)、醌氧化还原酶(NQO1)等,它们能够保护机体免受毒性物质(如致癌物、药物代谢活化产物等)及一些活性物质(如ROS)的侵害,因此也常称它们为二相抗毒酶(phase 2 detoxication enzymes)或二相抗氧化酶(phase 2 antioxidant enzymes)。很明显,诱导这些酶的表达,能够有效地减少外来物质引发的相关疾病。目前认为,药物代谢二相酶(简称二相酶)的表达主要是通过Keap1-Nrf2-ARE通路。ARE是抗氧化反应元件,它位于几乎所有二相酶基因的5`启动区,多种不同类别的物质能通过ARE来诱导二相酶基因的转录。二相酶诱导物的信息传递给ARE主要是通过两种重要的蛋白质:Nrf2和Keap1。正常状况下Nrf2被Keap1控制(sequestered)在胞浆中,当受到诱导物的刺激后,Nrf2从Keap1上解离下来,进入胞核与Maf蛋白形成异二聚体(heterodimer)并与ARE结合,最终导致二相酶基因的转录。既然二相酶在体内发挥着重要的抗毒、抗氧化作用,研究者们一直在寻找高效低毒的诱导物来诱导它们的表达。但在应用过程中,有人发现一些人工合成的化学诱导物有毒副作用,因此很多人又转向从天然物质(如植物)中提取毒性较低的诱导物。在我国的传统中药中,有很多药物(如银杏、绿茶等)均具有明显的抗氧化、抗毒作用,但它们的作用机制却不明了,这就极大地限制了它们的开发、应用。目的:本研究以标准的银杏叶提取物(EGb)做为二相酶的诱导物,探索其对一些二相酶的诱导作用及其分子机制。标准的EGb含24%黄酮类(flavone glycosides)和6%萜类(terpenoids),国外称之为EGb761,前人在细胞和动物模型上均已证实其有很强的抗氧化、抗毒作用,但其诱导药物代谢二相酶的机制却鲜有报道。方法:1、在转录水平检测EGb对两种典型的二相酶GCLC和GST-P1的诱导作用。用不同浓度EGb处理Hepa1c1c7细胞,消化并破碎细胞,抽提总RNA,用定量RT-PCR来测定两种酶基因的转录水平,以看家基因GAPDH为参照。2、在翻译水平检测EGb对GCLC和GST-P1的诱导作用。分别用不同浓度的EGb处理Hepa1c1c7或HepG2细胞,消化并破碎细胞,抽提胞浆内总蛋白质,然后用Western blot测定胞浆内GCLC和GST-P1蛋白质含量。3、在酶功能水平检测EGb对GCLC和GST-P1的诱导作用。分别用不同浓度的EGb处理Hepa1c1c7或HepG2细胞,测定胞浆中GSH含量或GST活性。4、NQO1-ARE报告基因的检测。分别给Hepa1c1c7细胞转导野生型和突变型的NQO1-ARE报告基因质粒。野生型的NQO1-ARE报告基因是这样构成的:取小鼠NQO1基因上游1016 bp的区域,把其插入pGL3-Basic荧光报告载体构成-1016/nqo5′-luc。突变型的NQO1-ARE报告基因则是把该载体中的ARE去除掉。分别用不同浓度的EGb处理两类细胞,检测EGb对二相酶的诱导作用是否通过ARE?5、检测Nrf2的核移作用。分别用不同浓度的EGb处理Hepa1c1c7或HepG2细胞,消化并破碎细胞,抽提核内总蛋白质,然后用Western blot测定核内Nrf2含量。6、检测EGb对Keap1的抑制作用。分别用不同浓度的EGb处理Hepa1c1c7或HepG2细胞,消化并破碎细胞,抽提胞浆总蛋白质,然后用Western blot测定它们胞浆内Keap1的蛋白质含量。结果:1、在基因转录、蛋白质表达及酶功能水平上均证实EGb对两种典型的二相酶GCLC和GST-P1有诱导作用。2、在NQO1-ARE报告基因的检测中,EGb能够诱导野生型报告基因的表达,但不能诱导突变型(敲除ARE序列)报告基因的表达。3、细胞受到EGb作用后,转录因子Nrf2转移到核内的量明显增加。4、细胞受到EGb作用后,胞浆内Keap1的量明显减少。结论:1、EGb对二相酶GCLC、GST-P1和NQO1均有诱导作用。2、EGb对二相酶的诱导作用通过ARE。3、细胞受到EGb作用后,转录因子Nrf2从Nrf2-Keap1复合物上解离,使Nrf2转移到核内的量明显增加(Nrf2可与ARE相互作用,促进二相酶基因的转录)。4、细胞受到EGb作用后,胞浆内Keap1的量明显减少(由于Keap1受到了抑制,从而对Nrf2的控制因素相对减少,可使更多的Nrf2解离出来,进入核内以促进二相酶基因的转录)。总之,EGb对药物代谢二相酶(GCLC、GST-P1、NQO1)有诱导作用,这种作用的机制是通过Keap1-Nrf2-ARE通路。