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哺乳动物卵母细胞质量是确保受精和胚胎发育的基础,由环境污染和卵母细胞成熟过程中减数分裂分子调控网络异常等原因造成的卵母细胞质量下降,会严重影响哺乳动物早期胚胎发育,从而影响动物的繁殖能力。马拉硫磷(Malathion,MAL)作为一种高效低毒的有机磷杀虫剂在农业防虫害中被广泛应用,但是高浓度的马拉硫磷会引起人类和动物急性中毒反应,长时间低浓度接触马拉硫磷则会在细胞水平引起染色体畸变,因此马拉硫磷具有潜在的细胞毒性。有报道表明马拉硫磷会影响动物卵母细胞成熟,但是关于其如何影响哺乳动物卵母细胞质量仍不清楚。猪卵母细胞成熟要经历复杂而精细的减数分裂过程,其中染色体乘客蛋白复合物(Chromosomal Passenger Complex,CPC)在减数分裂过程中呈现高度动态分布,在减数分裂各个时期承担相应功能。SURVIVIN蛋白作为CPC亚基之一,对CPC在卵母细胞中的动态定位有一定作用,但是对CPC功能亚基AURORA B激酶的作用还未有研究。围绕上述问题,本研究利用猪卵母细胞体外培养体系,研究马拉硫磷对猪卵母细胞减数分裂成熟的影响及其影响机制,同时还探究了SURVIVIN基因在卵母细胞减数分裂中的作用。具体研究结果如下:1.马拉硫磷处理会降低猪卵母细胞第一极体(First Polar Body,PBI)排出率,而且该影响具有剂量依赖性。马拉硫磷处理影响了卵母细胞减数分裂过程中纺锤体组装和染色体排列,扰乱了皮质颗粒正常分布,并提高了成熟卵母细胞中活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平。2.本研究利用RNA-seq技术,检测发现马拉硫磷处理改变了猪卵母细胞中2917个基因的转录水平,且大多数基因与氧化应激、脂滴发育和能量代谢有关。向马拉硫磷处理的猪卵母细胞中添加褪黑素(Melatonin,MLT),能有效改善这些基因转录水平的变化。荧光定量PCR结果显示,马拉硫磷处理的猪卵母细胞中,脂质代谢相关基因PLIN2和PPARγ显著下调,抗氧化抗凋亡相关基因GPX4、TP53和SOD2显著上调。蛋白质免疫印记结果显示,马拉硫磷处理的猪卵母细胞中PLIN2和PPARγ的蛋白水平显著降低。3.本研究发现向马拉硫磷处理的卵母细胞成熟培养基中添加褪黑素能够显著抑制马拉硫磷对猪卵母细胞成熟的损害。褪黑素能够提高马拉硫磷处理的卵母细胞的成熟率,使马拉硫磷处理的猪卵母细胞中纺锤体组装异常比率、皮质颗粒异常分布比例和ROS水平降低。此外,向马拉硫磷处理的猪卵母细胞培养基中添加褪黑素后,脂滴代谢相关的基因表达(PPARγ和PLIN2)能够恢复到正常水平。并且马拉硫磷处理导致的PLIN2与脂滴共定位的异常状况也得到显著改善。此外,添加褪黑素使卵母细胞中脂滴体积减小,脂滴数目增多,且使卵母细胞中脂质过氧化程度下降到正常水平。利用孤雌激活技术,发现添加褪黑激素能够将马拉硫磷处理的猪卵母细胞的孤雌激活比率,以及孤雌激活胚胎的囊胚率提高到正常水平。4.SURVIVIN对猪卵母细胞成熟至关重要。SURVIVIN基因在卵母细胞生发泡期(Germinal Vesicle,GV)和生发泡破裂(Germinal Vesicle Break Down,GVBD)时高表达,而SURVIVIN蛋白主要定位于GV期的生发泡内,在GVBD后主要定位于染色体上。5.利用RNA干扰技术在猪卵母细胞体外成熟期间特异性地降低SURVIVIN基因表达,结果显示,SURVIVIN基因KD(Knock Down,KD)的卵母细胞中,染色体不能准确地排列于赤道板两侧,从而使减数分裂进程停滞于减数第一次分裂中期。此外,在SURVIVIN KD的卵母细胞中,AURORA B的蛋白磷酸化水平降低,荧光定量PCR结果显示,与纺锤体组装检查点(Spindle Assembly Checkpoint,SAC)相关的MAD2L1的转录降低,此外,通过基因过表达技术,还观察到SURVIVIN KD的卵母细胞中,细胞周期蛋白B1(CYCLIN-B1,CCNB1)的降解受到抑制。综上所述,本研究发现马拉硫磷能够影响猪卵母细胞核成熟和胞质成熟;通过降低PLIN2蛋白和PPARγ蛋白水平影响卵母细胞内脂质代谢,破坏卵母细胞减数分裂进程。添加褪黑激素对马拉硫磷诱导的猪卵母细胞体外成熟损伤具有较好的保护作用。而在猪卵减数分裂过程中,SURVIVIN通过调节AURORA B蛋白的活性,使其在减数分裂进程中发挥正常作用。SURVIVIN能够促进CCNB1蛋白在减数第一次分裂后期及时降解,维持MAD2L1和CDH1的转录水平,确保纺锤体组装检验点SAC发挥作用,进而促进成熟促进因子(Maturation Promoting Factor,MPF)降解,从而使猪卵母细胞在减数第一次分裂中期所有染色体正确排列在赤道板上,顺利通过MI期并进入AI期,并发育到第二次减数分裂中期。