肝癌是消化系统常见的恶性肿瘤,对肝癌的防治研究具有积极意义。近年来对肿瘤转移机制的研究发现,肿瘤转移是一个复杂过程,在这一过程中有多个因素参与了转移的调控,肝癌细胞的侵袭和转移是恶性肿瘤的生物学本质,也是肝癌治疗失败和患者致死的主要原因,随着生物技术的发展,从基因水平上入手,解决肝癌的转移有了实现的可能。基因芯片技术作为一个有力的工具应运而生,可提供全基因组范围的生物学研究。由于基因芯片高速度、高通量、集约化和低成本的特点,其诞生以来就受到科学界的广泛关注。芯片技术在疾病诊断,特别是肿瘤的判别、比较肿瘤和正常组织、鉴别组织来源、肿瘤的亚分类等基础研究上具有重要作用。以前肿瘤研究方法中只针对某一单个基因进行研究,没有横向比较,高密度基因芯片技术可以提供平台进行多种基因的横向比较,探讨在某一模型中哪些基因起关键作用。本实验以临床转移肝癌标本为研究对象,通过SuperArray基因芯片技术对肝癌转移相关基因进行筛选,并通过免疫组织化学染色、RT-PCR和免疫印迹等技术进行临床标本验证,结合患者临床相关资料,探讨筛选出的基因与患者年龄、病程、肿瘤类型、临床分期及转移之间的关系。再通过肝癌细胞体外培养模型观察其表达及抑制后的转录水平、蛋白水平的变化及细胞侵袭力的变化。通过以上研究,探讨基因芯片筛选出的肝癌转移相关基因在肝癌发生发展中的作用,为肝癌的临床治疗提供研究基础。主要结果及结论如下:第一部分:肝细胞癌肿瘤转移相关基因SuperArray基因芯片表达研究1、选取正常肝组织、未转移肝细胞癌和转移肝细胞癌组织进行肿瘤转移基因芯片检测,结果发现未转移肝癌较正常组织表达上调3倍以上的基因有33个,转移肝癌较正常组织表达上调3倍以上的基因有50个,转移肝癌较未转移肝癌表达上调3倍以上的基因有13个。未转移肝癌较正常组织表达下调3倍以上的基因有5个,转移肝癌较正常组织表达下调3倍以上的基因有9个,转移肝癌较未转移肝癌表达下调3倍以上的基因有3个。2、根据实验结果选择上调基因VEGF和组织蛋白酶L和下调基因Kai-1和Cadherin 11进行验证,通过RT-PCR和WB方法证实了基因芯片的检测结果。第二部分:肝细胞癌Cathepsin L临床表达特征及与血管生成关系选取肝癌组织标本58例,其中高分化18例,中分化18例,低分化22例,临床分期Ⅰ-Ⅱ期26例,Ⅲ-Ⅳ期32例,有转移28例。免疫组化法、RT-PCR和免疫印迹法进行Cathepsin L,VEGF和CD34检测,统计实验结果。结果发现1、肝癌Cathepsin L表达与患者性别和年龄无相关性,与肝癌病理分级有显著相关性,分化越低的肝癌,Cathepsin L表达越强。2、肝癌Cathepsin L表达与肝癌临床分期有显著相关性,晚期肝癌Cathepsin L表达强于早期肝癌。3、临床晚期肝癌中VEGF表达强度高于早期肝癌,低分化肝癌VEGF表达强度高于高中分化肝癌,肝癌Cathepsin L表达强度变化与VEGF表达强度呈相同趋势,呈正相关关系。4、肝癌不同年龄组MVD无显著区别,肝癌临床晚期MVD显著高于早期肝癌,低分化肝癌MVD显著高于高中分化肝癌。统计分析表明,肝癌MVD与VEGF及Cathepsin L表达强度呈正相关。第三部分:RNA干扰沉默Cathepsin L基因表达对肝癌细胞影响实验研究肝癌细胞分为正常对照组(正常组)、转染对照组(对照组)和Cathepsin L siRNA转染实验组(转染组),观察时间为转染后1d,3d和6d。转染组进行Cathepsin L siRNA转染,MTT法及流式细胞技术检测细胞增殖状况,免疫荧光、RT-PCR及WB法进行Cathepsin L检测,transwell小室法进行细胞侵袭力测定。结果发现:1、RNAi可有效沉默肝癌细胞Cathepsin L mRNA转录和蛋白表达,同时抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡,提示Cathepsin L在肝癌细胞的生长和增殖中起重要作用,是肝癌细胞增殖和细胞凋亡通路的关键性生物因子之一。2、Cathepsin L表达受抑导致肝癌细胞侵袭力相对降低说明Cathepsin L是肝癌细胞浸润转移的重要生物学因素,同时提示RNAi技术作为肿瘤治疗的新途径。