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背景和目的肿瘤的发生是细胞增殖与细胞凋亡失衡所致，受细胞内外多种因素控制。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)是一类内源性细胞抑制因子。在很多物种中IAP起抑制凋亡的作用，其过度表达引起凋亡不足与肿瘤发生密切相关。因此以IAP为靶点，寻找有效的IAP抑制剂有广泛的应用前景。Livin作为一种新发现的凋亡抑制蛋白(IAP)抑制细胞凋亡，其存在于胚胎组织、胎盘组织和一些恶性肿瘤组织中，并在包括食管癌在内的多种肿瘤组织中呈现异常表达，与肿瘤的发生、发展、预后及耐药相关，将可能成为抗肿瘤治疗的潜在靶点。在基因治疗方面，RNA干扰技术和反义核苷酸技术也日趋成熟，被使用来达到干扰细胞内某些基因的表达，抑制和杀伤肿瘤细胞。Livin作为一种新发现的凋亡抑制蛋白(IAP)，抑制其在细胞内的表达，能否起到抑制食管癌细胞作用。为此，本实验拟构建针对人Livin基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体，观察RNA干扰对食管癌细胞Livin基因表达的沉寂作用。通过调控食管癌EC9706细胞株Livin基因的表达，观察对食管癌细胞生长速度、细胞凋亡情况的影响。方法利用Takara、Ambion和promega siRNA靶序列分析设计系统，扫描人Livin(livinα和livinβ)cDNA编码序列，依据siRNA靶序列设计原则，经BLAST同源性分析选择确定19个碱基的siRNA靶序列，同时随机组合出一条对照序列。分别合成2对编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火成双链DNA；用BamHI和ClaI双酶切siRNA表达载体pSUPER-neo；将双粘livinα和livinβ发卡样siRNA片段分别连接入siRNA表达载体pSUPER-neo中；利用BamHI和ClaI双酶切筛选鉴定重组子，并对重组子命名pSUPER-neo-Slil、pSUPER-neo-Sli2和pSUPER-neo-C；)对插入序列进行DNA序列分析。用脂质体包裹分别转染沉默Livin表达的siRNA载体以及livinα和livinβ表达载体入食管癌细胞EC9706。荧光定量RT-PCR检测Livin mRNA表达情况，测定细胞生长曲线和Caspase-3活性，检测细胞凋亡的影响。结果1．通过筛选并通过同源序列检索和进一步优选，最后确定19个碱基为siRNA靶序列：GCGTCTGGCCTCCTTCTAT(440～458)和GTCTGGCCTCCTTCTATGA(442～460)。2．siRNA发卡DNA的退火后，电泳可见明亮条带，均位于约60bp处，与设计完全一致。3．用BamHI和ClaI双酶切对重组质粒进行鉴定，得到pSUPER-neo-Slil、pSUPER-neo-Sli2和pSUPER-neo-C。4．对重组子pSUPER-neo-Slil、pSUPER-neo-Sli2和pSUPER-neo-C插入片段DNA序列测序，结果与设计完全一致。5．转染Livin siRNA载体的EC9706细胞经RT-PCR检测显示Livin基因的表达水平明显降低。6．转染siRNA载体沉默Livinα/β表达，细胞凋亡率、Caspase-3活性显著增加。结论1．设计出针对Livinα、Livinβ的发卡样siRNA寡核苷酸片段。2．成功构建出针对Livinα、Livinβ的siRNA表达载体pSUPER-neo-Slil、pSUPER-neo-Sli2。3．siRNA表达载体转染食管癌细胞后能显著降低细胞Livinα或Livinβ表达。4．调控食管癌EC9706细胞的Livin表达，可有效改变食管癌EC9706细胞生物学行为；Livin基因可能成为肿瘤治疗上有前途的分子靶点。