背景妊娠滋养细胞肿瘤包含一系列与妊娠相关的肿瘤性疾病,主要包括侵袭性葡萄胎、绒毛膜癌,以及较为罕见的其他类型。侵袭性葡萄胎与绒癌起源于绒毛滋养层细胞,具有与其他体细胞来源实体肿瘤截然不同的生物学特性。治疗方面,绒癌常使用多种药物联合化疗的方案,如EMA-CO、FAEV等,但部分患者因化疗耐药、肿瘤复发,5年生存率受到严重影响。自CTLA-4抑制剂2011年首次获批后,多种免疫检查点抑制剂陆续进入肿瘤治疗指南,改变了多种肿瘤的治疗图景。对正常胎盘组织和多种妊娠滋养细胞肿瘤病理标本的研究发现,PD-L1均高表达,进一步的研究发现PD-L1在维持正常胎盘组织以及绒癌的免疫耐受发挥重要作用。由此,将免疫检查点抑制剂应用在绒癌患者中,也获得了较好的缓解率。但部分患者可出现对PD-1/PD-L1抑制剂的原发耐药或继发耐药,可能存在其他的免疫抑制性分子或免疫逃逸路径。目前发现了除PD-1/PD-L1、CTLA-4外的多种负性免疫检查点在肿瘤微环境中发挥免疫抑制性作用,如TIM3、B7-H3等。VISTA是2011年发现的一种负性调节T细胞活性的PD-L1同源分子。VISTA表达在多种细胞中,具有免疫抑制活性,可通过多种途径抑制抗原呈递细胞与T细胞,与其他分了不同之处在于VISTA共同表达在肿瘤细胞与免疫细胞上。尽管在除免疫细胞外的正常组织和多数肿瘤中VISTA均无表达,但在胎盘和不同类型的妊娠滋养细胞肿瘤中均发现了 VISTA的高表达,但VISTA在绒癌发生、发展过程中的作用和相关机制仍不清楚。本课题组发现,在JEG-3细胞系中敲减VISTA可以显著降低绒癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力,VISTA在体内环境如何影响绒癌细胞系有待进一步研究阐明。目的本研究旨在使用敲减VISTA的绒癌细胞系与野生型绒癌细胞系分别构建皮下移植瘤小鼠模型及肺转移模型,探究敲减VISTA对绒癌细胞系在体内成瘤的干扰效果,以及相应的分子通路改变,进一步验证体外试验中发现的VISTA对增殖、迁移、侵袭等肿瘤细胞活动的影响以及敲除后的干扰效果,为VISTA在绒癌中发挥的作用及相关机制提供更多证据。方法1.将已经通过慢病毒转染构建的敲减VISTA JEG-3细胞系与野生型JEG-3细胞系分别稀释至不同浓度,在裸鼠腋下接种不同稀释浓度的肿瘤细胞悬液,统计成瘤率,记录皮下移植瘤生长速度,根据两组实际情况得到最佳浓度。按照前述所得最佳浓度稀释两种细胞,得到相同浓度的细胞悬液,在裸鼠双侧腋下分别接种,观测裸鼠移植瘤生长潜伏期,裸鼠进食、攻击行为等一般情况,记录皮下移植瘤生长曲线;2.按照最佳浓度在裸鼠尾静脉注射敲减型与野生型JEG-3细胞系,观察裸鼠一般状况,每周安乐死处死一组裸鼠,解剖裸鼠观察肺部大体标本、显微镜下移植瘤成瘤情况等;3.安乐死处死所有裸鼠,剥离皮下移植瘤,标本分别用于Western Blot及免疫组化染色,验证转移瘤绒癌细胞系来源、VISTA敲减情况,检测P53、HSP90、NFκB、β-catenin等分子的表达情况。结果经过初步实验,野生型及敲减型绒癌细胞系JEG-3最适宜的皮下接种浓度为2.5×107/mL,于最佳成瘤浓度接种后,移植瘤于裸鼠双侧腋下呈快速外生型生长,晚期可见瘤体出血。VISTA敲减型细胞系移植瘤生长落后于野生型JEG-3细胞系。VISTA敲减型JEG-3细胞系在肺部形成转移瘤的成瘤率较低、成瘤潜伏期时间更长,病理解剖后可见移植瘤满布异型细胞,hCG染色强阳性,敲减型VISTA染色不着色。Western Blot及免疫组化染色发现敲减型细胞系移植瘤中NFκB、β-catenin表达显著降低,P53、HSP90表达未见明显改变。结论在裸鼠皮下移植瘤以及肺转移模型中探究了 VISTA对绒癌细胞系的影响,验证了敲除VISTA对绒癌细胞系增殖、克隆能力的干扰,间接支持了敲除VISTA降低了绒癌细胞系的迁移、侵袭能力,初步研究了 VISTA作用于绒癌细胞系的相关分子通路,发现可能与NFκB、β-catenin在内的多种分子通路相关。