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目的本研究在收集正常体重及肥胖个体网膜脂肪组织,以及构建饮食诱导肥胖小鼠模型的基础上,明确受试个体血糖、血脂等一般资料以及网膜脂肪组织G蛋白偶联受体120(G Protein Coupled Receptor 120,GPR120)、G蛋白偶联受体40(G Protein Coupled Receptor 40,GPR40)与Krüppel样因子15(Krüppel-Like Factor 15,KLF15)表达之间的相关性;在体外培养小鼠脂肪细胞的基础上,观察游离脂肪酸(Free Fatty Acid,FFA)是否通过上调/激活GPR120/GPR40/p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)信号通路抑制脂肪细胞KLF15的表达,继而导致脂肪细胞糖代谢紊乱。通过以上研究,明确FFA对KLF15表达的影响,并探讨其可能的分子机制,为临床寻找治疗肥胖、胰岛素抵抗、炎症及相关代谢疾病新靶点提供实验依据和理论基础。方法(1)以体质指数(Body Mass Index,BMI)为标准,将受试个体分为正常体重组(Normal Control,NC组,n=30)和肥胖组(Obesity,OB组,n=30),收集受试个体身高、体重、腰围、臀围等一般资料及血糖、血脂水平;qRT-PCR和Western Blot技术检测受试个体网膜脂肪组织中KLF15表达水平;(2)24只C57BL/6健康雄性小鼠,分别进行正常饮食(Normal Diet,ND,n=8)和高脂饮食喂养(High Fat Diet,HFD,n=16),动态监测小鼠体重及Lee’s指数等变化情况,构建肥胖小鼠模型;肥胖小鼠模型成功建立后,腹腔注射AH7614和GW1100阻断GPR120和GPR40,收集小鼠血清,试剂盒检测小鼠血糖、血脂水平;收集小鼠内脏脂肪组织,qRT-PCR技术检测GPR120、GPR40、KLF15和下游因子的表达水平以及p38 MAPK磷酸化水平;(3)体外诱导小鼠3T3-L1前脂肪细胞为成熟的脂肪细胞,分别用不同浓度的棕榈酸(Palmitic acid,PA)、油酸(Oleic acid,OA)以及二者的混合物(PA:OA=1:2)作用于脂肪细胞,同时运用阻断剂AH7614、GW1100和SB203580分别阻断GPR120、GPR40以及p38 MAPK的磷酸化,qRT-PCR和Western Blot技术检测脂肪细胞GPR120、GPR40、KLF15和下游因子的表达水平以及p38 MAPK磷酸化水平,试剂盒法检测上清液中葡萄糖含量。结果1.人体组织实验1.1受试个体一般资料和生化指标水平比较OB组体重、腰围、臀围、腰臀比、体质指数和甘油三酯水平显著高于NC组(P<0.01)。1.2受试个体网膜脂肪组织KLF15表达水平比较OB组KLF15 mRNA及蛋白表达水平显著低于NC组(P<0.05)。1.3受试个体网膜脂肪组织KLF15 mRNA与一般资料和生化指标的相关性分析KLF15 mRNA表达水平与体重、腰围、臀围、腰臀比和甘油三酯水平显著负相关(P<0.05)。2.动物实验2.1构建肥胖小鼠模型C57BL/6小鼠经高脂饮食喂养9周后,高脂饮食喂养组(High Fat Diet,HFD)小鼠体重(29.99±0.3520)g显著高于普通饮食喂养组(Normal Diet,ND)(23.45±0.5760)g(P<0.001),且超过ND组小鼠的20%;HFD组小鼠Lee’s指数(15.11±0.04788)显著高于ND组(14.08±0.1178)(P<0.001);HFD组小鼠体内脂肪组织含量显著多于ND组小鼠(P<0.001),提示饮食诱导肥胖小鼠模型构建成功。并且高脂饮食喂养第9周后,HFD组小鼠空腹血糖、总胆固醇和甘油三酯水平显著高于ND组(P<0.05)。2.2小鼠内脏脂肪组织KLF15以及糖脂代谢关键因子mRNA表达水平的比较高脂饮食喂养至第9周,HFD组小鼠内脏脂肪组织KLF15及下游靶基因脂肪源性胰岛素敏感因子(Adipose-derived Insulin-sensitizing Factor,adipolin)的mRNA表达水平显著低于ND组(P<0.05)。KLF15的mRNA表达水平与小鼠体重、Lee’s指数、甘油三酯和总胆固醇显著负相关,与GPR120、Adipolin和葡萄糖转运受体-4(Glucose Transporters 4,GLUT-4)显著正相关(P<0.05)。2.3内脏脂肪组织KLF15的mRNA表达水平与一般资料、生化指标和相关因子的相关性分析HFD组小鼠内脏脂肪组织KLF15的mRNA表达水平与Weight、Lee’s指数(Lee’s Index)、TG和TC显著负相关(P<0.05),与GPR120、Adipolin和GLUT-4显著正相关(P<0.05)。2.4阻断GPR120后,HFD小鼠脂肪组织中KLF15的表达高脂饮食喂养9周的HFD小鼠腹腔注射AH7614阻断GPR120,检测KLF15和相关因子的变化。结果显示,注射AH7614组HFD小鼠KLF15表达明显高于HFD组,p38 MAPK磷酸化水平显著降低(P<0.05)。2.5阻断GPR40后,HFD小鼠脂肪组织中KLF15的表达高脂饮食喂养9周的HFD小鼠腹腔注射GW1100阻断GPR40,检测KLF15和相关因子的变化。结果显示,注射GW1100组HFD小鼠KLF15表达明显低于HFD组,p38 MAPK磷酸化水平无显著变化(P<0.05)。3.体外细胞实验3.1 3T3-L1前脂肪细胞的培养及诱导分化3T3-L1前脂肪细胞呈上皮样,细胞内无明显空泡,细胞边界清晰;经诱导分化为成熟脂肪细胞后,可见细胞形态趋向圆形,细胞内部有大量圆形、大小不一和折光明显的脂滴聚集。通过油红O染色后可见脂肪细胞中大量脂滴被红染,证明3T3-L1细胞被诱导分化为成熟脂肪细胞。3.2 PA和OA混合液对脂肪细胞GPR120、GPR40、p38 MAPK以及KLF15表达的影响不同浓度(0μM,50μM,100μM,200μM,400μM,800μM)的PA和OA的混合液(PA:OA=1:2)作用脂肪细胞48h后发现,800μM混合液能够显著促进GPR120的表达以及p38 MAPK的磷酸化水平,而KLF15与GPR40的表达水平则均被显著抑制(P<0.05),同时脂肪细胞的糖消耗能力被显著抑制(P<0.01);800μM PA和OA的混合液作用于脂肪细胞的同时阻断GPR120后,KLF15的mRNA表达水平以及细胞葡萄糖消耗能力显著升高(P<0.05);800μM PA和OA的混合液作用于脂肪细胞的同时阻断GPR40后,KLF15的mRNA表达水平显著降低(P<0.05),而细胞葡萄糖消耗能力无显著差异;800μM PA和OA的混合液作用于脂肪细胞的同时阻断p38 MAPK磷酸化后,KLF15的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。3.3 PA对脂肪细胞GPR120、GPR40、p38 MAPK以及KLF15表达的影响不同浓度的PA(0μM,150μM,750μM,1500μM)作用于脂肪细胞后发现,随着PA浓度的增加,KLF15的mRNA及蛋白表达水平呈现逐渐降低的趋势,与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。1500μM PA刺激组GPR40和GPR120的mRNA及蛋白表达水平、p38 MAPK磷酸化水平显著高于空白对照组(P<0.05),脂肪细胞的糖消耗能力被显著抑制(P<0.05);与PA单独刺激组相比,1500μM PA刺激的同时阻断GPR120后,p38 MAPK磷酸化水平降低,KLF15的mRNA和蛋白表达水平以及细胞葡萄糖消耗能力显著升高(P<0.05);1500μM PA刺激的同时阻断GPR40后,p38 MAPK磷酸化水平、KLF15的mRNA和蛋白表达水平均无显著差异;1500μM PA刺激的同时阻断p38 MAPK磷酸化后,KLF15的mRNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.01)。3.4 OA对脂肪细胞GPR120、GPR40、p38 MAPK以及KLF15表达的影响不同浓度的OA(0μM,15μM,150μM,750μM)作用脂肪细胞48h后发现,750μM OA可显著促进脂肪细胞GPR120的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),而脂肪细胞的GPR40、KLF15的mRNA和蛋白表达水平以及细胞葡萄糖消耗能力均被显著抑制(P<0.05),p38 MAPK磷酸化水平无显著变化。与OA单独刺激组相比,750μM OA刺激同时阻断GPR120后,KLF15的mRNA和蛋白水平以及脂肪细胞葡萄糖消耗能力显著升高(P<0.05),p38 MAPK磷酸化水平无显著变化;与OA单独刺激组相比,750μM OA刺激同时阻断GPR40后,KLF15的mRNA和蛋白表达水平显著降低,p38 MAPK磷酸化水平以及脂肪细胞葡萄糖消耗能力均无显著变化。结论:(1)PA通过GPR120促进p38 MAPK的磷酸化,进而抑制KLF15表达,导致脂肪细胞糖消耗能力的降低。(2)OA通过GPR120(或GPR40)抑制KLF15,导致脂肪细胞糖消耗能力降低,此过程不依赖p38 MAPK的磷酸化。(3)GPR40不参与PA抑制脂肪细胞KLF15表达的过程