基因打靶技术与锌指核酸酶技术联合使用可以使外源基因定点整合到基因组，并有较高的整合效率，会推动转基因动物研究发展。本实验设计了一套锌指蛋白筛选系统和随机锌指库构建方法，并利用此系统筛选了针对牛β酪蛋白的锌指蛋白。将筛选到锌指蛋白构建相应的锌指核酸酶，并用于转基因打靶效率研究。研究表明，所筛选构建的锌指核酸酶可以提高基因打靶整合效率5-10倍。1.锌指蛋白筛选系统建立：本实验主要构建了报告载体（pReport-LacZ）、随机锌指蛋白表达载体（pBD-Gal11p-ZFS）和激活载体(PAD-Gal4)。报告载体载体为氨苄（Amp）抗性，其报告基因为β—半乳糖苷酶（LacZ），筛选基因为氨基糖苷腺苷酰基转移酶基因（aada，Sm），两个基因通过大肠杆菌多顺反子的串联序列实现串联表达。该载体具有多拷贝（20-50/cell）和单拷贝（1-2/cell）两种复制状态，两种复制状态是可调控的；随机锌指蛋白表达载体为氯霉素抗性（Cm），其可实现随机锌指片段的原核表达；激活载体为卡那霉素抗性（Kan），其表达激活结构域（RNAPα-Gal4）。2.随机锌指库构建：本实验采用随机引物和重叠PCR的方法获得随机锌指库序列，再通过PCR扩大，酶切、连接、电转化和提取质粒等步骤，完成随机锌指库构建，库容量大于1.48×1021（1518）。3.锌指蛋白筛选：通过对比试验确定了已建立的锌指蛋白筛选系统的最佳筛选条件。针对牛β-酪蛋白基因筛选锌指蛋白，并采用高通量β-半乳糖苷酶活性测定方法（High-throughput β-galactosidase assay）测定了锌指蛋白活性。4.基因打靶整合效率检测：本实验采用定量PCR方法和单克隆筛选的方法，从两个方面证明所筛选构建的锌指核酸酶可以基因打靶整合效率。总之，本实验成功建立了锌指蛋白筛选系统和随机锌指库。本实验所设计的随机锌指库构建方法具有耗时短、费用低、简单方便的特点，只要具备分生物学实验条件的实验室均可完成，可广泛应用。通过多次对比试验，确定锌指蛋白筛选的最佳条件。针对牛β酪蛋白的基因的一个位点成功筛选构建了四对锌指核酸酶真核表达载体，并研究其对基因打靶整合效率的影响。研究结果表明，所筛选构建的锌指核酸酶均能提高基因打靶的整合效率。