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油菜是目前我国种植面积最大、产量最高的油料作物之一，在我国农业经济中占有举足轻重的地位，由于油菜一生展叶不多，具有无限花序等生物学特点，叶片衰老进程严重影响油菜有效光合作用时间、影响光合产物的积累和荚果的充实。同时，由于干旱、水涝、病虫害等各种逆境的影响，一些油菜品种的叶片也不同程度地存在着早衰现象，成为产量增长的重要限制因子。本项目利用细胞分裂素生物合成基因工程技术对内源细胞分裂素对油菜叶片衰老进程的影响进行了研究，同时对内源细胞分裂素水平与植株抗逆性之间的关系进行了探讨，为进一步培育叶片衰老延缓、抗逆性提高、产量增加的油菜新品系打下了基础。 本论文主要覆盖了以下内容：油菜叶片衰老的初步研究、拟南芥衰老专一型启动子PSAG12和根癌农杆菌质粒异戊烯基转移酶ipt基因的克隆及PSAG12-ipt嵌合基因植物表达载体的构建、PSAG12-ipt嵌合基因遗传转化油菜的研究、转基因植株的分子检测及生理检测、ipt基因调控油菜叶片衰老进程的效果及内源细胞分裂素水平与植物抗逆性之间的关系等。研究结果摘要如下： 1．对双低油莱（Brassica napus）品种H165叶片衰老进程中的部分生理指标进行了检测，初步获得了油菜叶片叶绿素含量、内源细胞分裂素水平、SOD酶活性及MDA积累量的变化规律。结果表明，油菜叶片衰老进程中，叶片叶绿素含量、内源细胞分裂素含量、SOD酶活性及MDA积累量都发生了明显的量的变化并呈现一定的规律性。随着油菜叶片衰老，叶绿素含量、内源细胞分裂素含量、SOD酶活性明显下降。叶片全展前，细胞分裂素含量和SOD酶活性明显低于全展叶片，叶片全展时分别达到最大值，MDA积累则在叶片全展后迅速增加；叶片叶绿素含量在衰老进程中则持续下降，叶片全展后下降速度明显加快。相关性分析结果表明，叶片叶绿素含量与内源细胞分裂素含量、SOD酶活性及MDA积累之间具有高度的相关性，这为叶片衰老“激素调控理论”和“自由基伤害假说”提供了相应的证据，也为利用细胞分裂素基因工程技术调控油菜叶片衰老进程提供了理论依据。 2．成功克隆了拟南芥衰老专一型启动子序列PSAG12和根癌农杆菌质粒异戊烯基转移酶ipt基因，构建了PSAG12-ipt嵌合基因植物表达载体pAGT。克隆的PSAG12是拟南芥衰老专一型基因SAG12 5’端2130bp的非编码序列，包含有55 bp的5’-UTR、完整的衰老特异表达功能区域和增强子序列，无大多数高等植物所具有的典型的TATA box、CAAT box 2 张治礼 内源细胞 索调往油菜叶片宏老进程的研究等结构，全序列与Genbank中公布序列的同源性高达99．9％。克隆的加t基因由720hp核昔酸构成，具有完整的阅读框架，与Genebank中公布序列的核昔酸同源性为100％。通过中间载体pBAG，成功构建了P。l。－ipt jK％4因植物表达载体PAGT，为进一步开展控制油菜、小麦、玉米等农作物叶片衰老进程、提高作物产量和抗逆性的研究打下了的基础。 3．利用直接导人法将植物表达载体pAGT分另导人农杆菌LBA4404和EHA105茵株，以油莱子叶柄和下胚轴段为外植体开展了农杆菌LBA4404和EHA105介导的P。；。－ipt嵌合基因遗传转化油莱的研究，并成功获得了一批具有卡那霉素抗性的抗性转化植株。统计数据显示，经过3－4代抗性培养基（25mp／L，Kan）筛选培养后，油菜子叶柄遗传转化率不足0．l％，下胚轴段遗传转化率不足0．5％。 4．利用双重PCR技术对其中的17株抗性油菜植株进行了检测，对PCR e双阳性植株基因组总DNAjflitr了Southern杂交，结果表明，本研究成功获得了11株转P。l。－iPt嵌合基因的油菜植株。 5．对转基因植株在大棚中的生长发育情况进行了系统的观察。结果显示，11株转基因植株中的9株与对照表现没有明显的差异，植株生长发育正常；另外两株编号lines和line7的转基因植株虽没有出现生长发育异常现象，但叶片衰老时间明显延迟，长势较旺盛。lines和line7植株下部长柄小叶衰老进程延迟了20－30天，主茎短柄叶衰老延迟了30－40天，上部无柄叶则延迟了20－30天。 6．对lines和lne7两株转基因植株不同叶位叶片细胞分裂素和叶绿素含量进行的检测结果表明，全展叶片下部叶片叶绿素含量、细胞分裂素含量下降速度受到明显抑制，全展叶片下部第六片叶叶绿素含量约为对照的2－3倍，细胞分裂素含量约为对照的4－5倍。这一结果证实，本研究成功获得了两株外源ipt基因特异表达并能促进衰老叶片细胞分裂素生物合成、延缓叶片衰老的PsAOI叶pt转基因油菜植株。目前，我们已收获到包括lines和lne7在内的六份转基因油菜第1代种子。 7．对lines和ine7两株转基因植株不同叶位叶片SOD ＄活性和MDA积累憎况进行的检测结果显示，转基因植株工ines和line7叶片全展后，SOD酶活性下降幅度明显低于对照，MDA积累虽与对照一致也呈上升趋势，但上升幅度明显趋纫，即SOD f活性下降和MDA积累都受到了抑制。SOD酶活性和MDA积累量是植株抗逆性强弱的重要指标。这一检测结果表明，本试验初步获得了抗逆性增强的转基因油莱植株，同时也为植