胃肠道菌群是机体的重要组成部分,其种类繁多,数量庞大,约有30多个属500多种细菌,大约1×1014个活细菌,比机体细胞总数还多10倍。正常菌群是动物生存的必要条件,其结构多样性及种群结构的变化与机体的健康和疾病的发生、发展有密切关系。PCR-DGGE是基于16SrDNA的可变区PCR扩增的序列特异性熔链温度不同进行分离的,并且可以检测出序列中一个核昔酸的差异。因此通过该技术直接扩增16SrDNA的可变区,构建DNA指纹图谱,建立快速检测的分子分型平台,能广泛用于肠道复杂微生物区系菌群结构演替和多样性分析研究,是目前应用于胃肠道菌群结构多样性和种群结构变化研究的一种较为广泛的分子生物学方法。本文利用变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gardient Ge1 Electrophoresis,DGGE)技术,对两窝(A、B两组)共16头不同时间段(0、1、3、9、15、21、28、35日龄)健康仔猪的十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠中细菌菌群的结构多样性和动态变化进行了检测,为今后对仔猪肠道菌群的进一步研究奠定一定的实践基础,本课题建立出一套适用于实验室研究动物肠道细菌多样性的DGGE检测方案。首先应用DGGE技术分析仔猪肠道细菌的多样性,了解仔猪肠道菌群的时空变化规律,并寻找出一部分优势菌群;然后对共有条带和特殊条带进行回收、克隆并测序,利用Blast工具将测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行比对,找出与其同源性最高的DNA序列,并对序列进行了分析。采用DGGE技术分析细菌多样性时,凝胶浓度为7.15%,变性剂梯度范围在30%-60%之间,恒温60℃,85V电泳约12h左右,DGGE带谱的分离效果较好。结果表明:小猪在出生后数小时(吃初乳前)就可以检测到有少量细菌定植肠道,随着小猪日龄的增长,各个肠段细菌种类和数量也逐渐增多,至3日日龄时细菌种类和数量已相当丰富。随后至9日龄、15日龄时小猪肠道内细菌种类、数量逐渐变缓。至20日龄肠道内细菌种类和数量有所增加,随后28日龄又有所下降,至35日龄时各个肠道细菌种类和数量逐渐趋于稳定。其中十二指肠和空肠细菌种类和数量相对较少,盲肠和结肠最多。通过对DGGE图谱中一些共有以及特殊的条带进行测序发现:切胶回收的条带所代表的细菌与现有数据库中的细菌有很高的同源性,大部分在90%以上,有的同源性甚至达到了100%。条带A0-1与已鉴定的Clostridium perfringens相似性为100%,表明仔猪出生数小时Clostridium perfringens就已经存在于仔猪的各段肠道。A1-1与已鉴定的Escherichiacoli相似性为99%,表明仔猪出生一天后Escherichia coli已经成为各段肠道的优势菌群。此外在三日龄仔猪肠道内检测到Lactobacillus acidophilus和lactobacillus vaginalis。随着仔猪日龄的增加,所能检测的绝大部分都为不可培养细菌。说明在仔猪断奶后期生长过程中,不可培养菌群、未经鉴定的菌群和一些未知的菌群可能起重要作用。在今后的研究中,有必要对DGGE出现的所有谱带进行克隆测序,并利用多种分子生物学技术来检测仔猪肠道系统中可能存在的微生物菌群结构,而且将各种方法结合起来综合分析,才能使结果更为客观、准确。另外,在仔猪生长过程中,可以通过控制仔猪肠道的优势菌群,提高仔猪的体重,增加抵抗力等,也为仔猪微生态制剂的研究、开发以及应用提供必要的理论基础。