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地方流行性牛白血病（enzootic bovine leukosis,EBL）是一类传染性较强的慢性肿瘤性疾病,全球多国均有发病报道。大量数据表明,患病奶牛极易因继发感染金黄色葡萄球菌而导致乳腺炎,进而影响奶牛产奶功能,造成巨大经济损失。该病病原为牛白血病病毒（bovine leukemia virus,BLV）,属于反转录病毒科（Retroviridae）,丁型反转录病毒属（Deltaretrovims）,感染动物后以前病毒形式整合到B淋巴细胞的基因组DNA中。有研究在感染奶牛的乳腺上皮细胞中检测到了 BLV p24蛋白的表达,这表明BLV能够侵害乳腺上皮细胞。乳腺上皮细胞是重要的泌乳细胞,也是免疫系统的第一道屏障,在奶牛泌乳以及先天性免疫中发挥着重要作用。BLV直接感染乳腺上皮细胞,改变其细胞命运,可能是BLV阳性奶牛产奶量下降以及乳腺炎发病率升高的重要原因。本研究利用分子流行病学调查,首次在宁夏回族自治区发现我国存在BLV基因4型毒株;利用蝙蝠肺细胞系（Tb 1 Lu）,成功分离鉴定了我国的BLV流行毒株;进一步,通过体外试验探究了 BLV感染对奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）增殖和凋亡的调控作用。具体研究如下:1.我国BLV流行病学调查基于env基因的遗传多态性,BLV被划分为11个基因型,即基因1型一基因11型。本研究在宁夏回族自治区的石嘴山、银川、吴忠、中卫等4个市采集了 219头奶牛的全血样品,运用本实验室建立的FRET-qPCR方法对样品进行检测,结果表明,上述地区BLV的总体阳性率为18.26%（40/219）,其中石嘴山、银川、吴忠、中卫4个市的阳性率分别为 17.31%（9/52）、23.33%（21/90）、10.34%（6/58）、21.05%（4/19）。运用临接法（Neighbor-joining,NJ）分析发现,阳性样品属于BLV基因4型和6型。与GenBank收录的代表BLV不同基因型的参考序列比较,结果发现本研究鉴定的毒株env基因共存在23处突变,其中9处为非同义突变,包括糖蛋白51（gp51）的6处突变和糖蛋白30（gp30）的3处突变。本研究首次在国内发现了 BLV基因4型毒株,并分析了其env基因的遗传多样性,相关突变是否对病毒致病性造成影响还需进一步的研究。2.体外BLV分离培养纯化BLV的分离培养需要借助敏感细胞系—胎羊肾细胞系（fetal lamb kidney cell line,FLK）,但该细胞在国内难以获得,导致国内科学家难以开展BLV的病原学、致病性、疫苗研制等相关研究。本研究通过FRET-qPCR方法检测和筛选了高病毒滴度的奶牛（编号:17985）,并将其外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）分别与蝙蝠肺细胞（Tb l Lu）、奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）、牛肾细胞（MDBK）进行共培养并连续传代,同时通过FRET-qPCR和间接免疫荧光实验（indirect immunoinfluscentassay,IFA）检测各组细胞的感染情况。FRET-qPCR结果显示,在感染初期,Tb 1 Lu-BLV、MAC-T-BLV、MDBK-BLV的拷贝数分别为1,723.328拷贝/反应、94.528拷贝/反应、0.169拷贝/反应;在连续11次传代后,拷贝数分别为4,407.497拷贝/反应、19.460拷贝/反应、1.765拷贝/反应。IFA结果显示,Tb 1 Lu-BLV特异性荧光随连续传代逐渐增多,并在连续13次传代后达到稳定感染状态;而其余两种细胞经过11次连续传代后未观察到特异性荧光。因此本研究利用敏感细胞系Tb 1 Lu成功完成了我国BLV流行毒株基因6型的分离纯化,有助于后续BLV病原学和疫苗研制等工作的开展。3.BLV感染对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响乳腺上皮细胞不仅是重要的泌乳细胞,并且作为免疫系统的第一道屏障,在先天性免疫中发挥着极为重要的作用,BLV感染所导致的细胞命运改变可能是其降低奶牛产奶功能和抗病能力的重要因素。本研究通过共培养等方法,建立了奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）体外感染BLV模型。试验分为五组,分别为（1）MAC-T与Tb l Lu-BLV共培养组;（2）MAC-T与Tb l Lu共培养组;（3）MAC-T单独培养组;（4）Tb l Lu-BLV单独培养组;（5）Tb 1 Lu单独培养组,每组设置8个重复（n=8）。通过Annexin V-FITC/PI和CCK-8对各组细胞的增殖和凋亡进行检测,利用RT-qPCR对细胞增殖和凋亡相关基因的表达水平进行定量。结果显示:BLV感染显著抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖和凋亡水平,显著下调促增殖基因KIF14和促凋亡基因Caspase-8、BID的表达水平并显著上调凋亡抑制基因KIF18B的表达水平。由此提示,BLV感染可能通过抑制奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡水平,影响其泌乳和先天性免疫应答功能,从而导致感染奶牛生产性能与抗病能力的下降。综上所述,本研究首次发现我国存在BLV基因4型毒株;利用Tb 1 Lu细胞对我国BLV流行毒株进行了分离鉴定;在体外水平明确了 BLV感染显著抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖和凋亡水平,显著下调促增殖基因KIF14和促凋亡基因Caspase-8、BID的表达水平并显著上调凋亡抑制基因KIF18B的表达水平。本研究的开展为后续BLV病原学和疫苗研制提供有利条件,同时为BLV防控和净化策略实施的必要性提供实验支撑。