牙齿缺失修复及牙周组织再生是口腔科学的工作和研究中心之一,目前临床上对牙周炎致骨缺损的治疗仍然是一个难题,而利用义齿包括固定义齿、活动义齿和种植义齿等修复是一类赝复体修复,缺乏真正意义上的生物修复。近年来,关于牙齿干细胞及组织工程技术的研究进展给牙齿和牙周组织生物再生带来了新的希望。诸多研究提示牙齿相关干细胞是牙齿再生和牙周组织再生的最佳种子细胞来源,具有较广阔的临床应用前景。然而,自体牙齿干细胞来源有限,如果牙齿干细胞能异体应用,就能明显扩大牙齿再生种子细胞来源,极大推进牙齿和牙周组织再生的发展。机体的免疫分为细胞免疫和体液免疫两部分,本课题组的前期研究发现牙齿相关干细胞不会引起细胞免疫应答,但是牙齿相关干细胞对机体体液免疫应答(B淋巴细胞)的影响尚不清楚。为了同种异体牙周膜干细胞能够将来安全地用于临床,本研究拟探讨牙周膜干细胞对同种异体B淋巴细胞功能的影响,并利用小型猪模型,观察牙周膜干细胞异体移植修复牙周炎骨缺损的能力及有无体液免疫排斥。本研究包括以下三个部分：第一部人牙周膜千细胞的培养与鉴定目的：分离培养及鉴定人牙周膜干细胞,为下一步对牙周膜干细胞的其他性能进行研究提供必要的基础和前提。方法：选取首都医科大学附属北京口腔医院口腔颌面外科门诊拔除阻生第三磨牙的患者,无菌条件下剥离牙根外牙周组织,参照以往关于人牙齿相关干细胞的培养方法及条件,分离培养人牙周膜干细胞,并通过倒置显微镜、流式细胞仪等对其生长特性、诱导分化能力,表面标志物进行观察。结果：原代培养的人牙周膜干细胞生长良好,呈梭性。牙周膜干细胞的克隆形成率为(15-28个/105)。流式细胞仪结果显示,分离培养的牙周膜干细胞中的STRO-1,CD146, CD90, SSEA-4, OCT-4,其表达阳性率分别为13.34±1.83%,80.61%士5.41%,98.67%±1.03%,88.67%±4.03%,95.33%士4.53%。经诱导分化后,牙周膜干细胞在体外有诱导分化成骨和成脂肪的能力。结论：人牙周膜干细胞可在体外成功培养,表现出良好的生长状态,并有横向分化的潜能。第二部分人牙周膜干细胞对同种异体B淋巴细胞的影响目的：在体外研究人牙周膜干细胞对同种异体B淋巴细胞功能的影响。方法：正常人外周血的B淋巴细胞与人牙周膜干细胞共培养,通过对B淋巴细胞增殖、凋亡、分化、趋化、分泌功能和共刺激分子表达的检测,从而研究牙周膜干细胞对B淋巴细胞功能的影响,同时用hBMSCs作同型对照,并通过Transwell实验,CBA、抗体中和实验等来研究牙周膜干细胞影响B淋巴细胞增殖和凋亡的可能机制。结果：经流式细胞术检测,牙周膜干细胞抑制由CpG ODN、 rCD40L、Anti-immunoglobulin (IgA+IgG+IgM)、IL-2和IL-4引起的B淋巴细胞增殖,且这种抑制具有浓度依赖性；延迟加入牙周膜干细胞也能抑制由上述刺激所引起的B淋巴细胞增殖。本研究还发现,牙周膜干细胞对B淋巴细胞表面的共刺激分子(CD40、CD80、CD86和HLA DR)的表达和分泌功能不产生影响,但对B淋巴细胞的分化和趋化功能有抑制作用。通过Transwell实验发现：牙周膜干细胞抑制B淋巴细胞增殖的机制可能是通过细胞接触和可溶性分子共同作用。通过流式细胞术检测发现：共培养后,牙周膜干细胞表面PD-1、 PD-L1和PD-L2表达发生改变；进一步利用抗体中和实验证明,牙周膜干细胞可能是通过PD-1和PD-L1来部分抑制B淋巴细胞增殖。凋亡实验表明,牙周膜干细胞并非通过促进B淋巴细胞凋亡来发挥免疫抑制作用,相反,牙周膜干细胞通过分泌IL-6抑制B淋巴细胞的凋亡。结论：hPDLSCs和hBMSCs类似,能够抑制B淋巴细胞的增殖,而且这种抑制作用呈浓度依赖性；hPDLSCs对B细胞的分化、趋化功能也有抑制作用,但对B细胞的抗原提呈功能和分泌功能无明显影响；hPDLSCs通过分泌IL-6抑制B淋巴细胞的凋亡；hPDLSCs通过PD-1及PD-L1部分抑制B淋巴细胞的增殖,与B淋巴细胞的凋亡无关。第三部分小型猪牙周膜干细胞同种异体移植后对机体体液免疫应答的影响目的：在体内研究牙周膜干细胞的异体移植后对机体体液免疫应答的影响。方法：选用雌性五指山小型猪12只,建立牙周炎骨缺损模型,同时分离、培养、扩增五指山小型猪和雄性贵州小型香猪牙周膜干细胞。建模后1个月开始治疗,分为4组：(1)空白对照组：建立实验性牙周炎模型后不做任何处理;(2)HA/TCP组：在建模后做翻瓣刮治+HA/TCP修复,覆盖以明胶海绵；(3)自体牙周膜干细胞+HA/TCP组：建模后做翻瓣刮治+自体牙周膜干细胞+HA/TCP修复,覆盖以明胶海绵；(4)异体牙周膜干细胞+HA/TCP组：建模后做翻瓣刮治+雄性贵州小型香猪牙周膜干细胞+HA/TCP修复,覆盖以明胶海绵。观察指标包括临床观察(牙周探诊深度、附着丧失等)、影像学检查、血液学检查、组织学观察和体液免疫指标等的检测。结果：成功建立牙周炎模型,各组模型之间无统计学差异；治疗后12周,发现自体牙周膜干细胞组和异体牙周膜干细胞组的牙周指数(牙龈退缩、牙槽骨缺失和牙周袋深度)与空白对照组、HA/TCP组相比有统计学差异,但治疗后自体牙周膜干细胞组和异体牙周膜干细胞组牙周指数之间无统计学意义。CT扫描发现,治疗后12周,自体牙周膜干细胞组和异体牙周膜干细胞组都有明显的新生骨质影像,而空白对照组和HA/TCP组却不明显。血液学研究表明,无论是治疗前还是治疗后各个时间点,各治疗组的血常规、血生化、免疫球蛋白和体液免疫学指标(CD20, CD25, B220)都没有统计学差异,同时检测龈沟液和牙周组织的免疫球蛋白也没有统计学差异,说明异体干细胞移植组在治疗后无炎性病变产生,无肝肾功能的损伤,无近期或者远期体液免疫反应产生。组织学观察表明,在自体牙周膜干细胞组和异体牙周膜干细胞组,都有明显的牙槽骨、牙骨质和牙周膜再生,骨缺损基本修复,而在空白对照组和HA/TCP组,仍可见明显的典型牙周炎表现,包括深牙周袋、缺乏新骨和新牙周膜形成。最后通过细胞移植术后1周和2周,对自体移植组和异体移植组的局部牙周组织IL-6、PD-1、PD-L1、PD-L2的mRNA检测,发现IL-6的mRNA在两组间无统计学意义；而PD-1、PD-L1、PD-L2的mRNA,异体组均明显高于自体组。结论：异体牙周膜干细胞能够使牙周骨质再生；异体牙周膜干细胞在小型猪体内不会引起机体体液免疫反应,可能是通过PD-1及其配体来起作用。