论文部分内容阅读
目的:探讨ERβ-SATB2通路调节骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)干性及其在绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis,OPM)发生中的作用,为OPM的治疗提供的新的理论和实验依据。方法:(1)通过切除双侧卵巢构建OPM动物模型,组织贴壁培养法分离培养动物模型来源的OVX-BMSCs(去势组)和Sham-BMSCs(假手术组)。Micro-CT及苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色对两组动物模型的四肢骨形态组织学进行分析,同时,采用克隆形成实验、RT-PCR及Western blot方法对两组细胞的干性能力进行分析。诱导成骨分化后,茜素红染色BMSCs检测两组钙结节的情况,RT-PCR及Western blot对两组成骨相关基因对比分析。(2)检测Sham-BMSCs,OVX-BMSCs,OVX-BMSCs+雌激素(estrogen,E2),分析三组的克隆形成率,干性因子的表达,以及钙结节的形成,成骨相关基因的变化,同时观察SATB2的表达水平。(3)OVX-BMSCs分别加入siRNA-ERβ,ICI182,780(雌激素受体阻断剂),继续分析三组的克隆形成率,干性因子的表达,以及钙结节的形成,成骨相关基因的变化,同时观察SATB2的表达水平。(4)生物信息学软件预测SATB2上游启动子区潜在的ERE序列,通过染色质免疫共沉淀和双萤光素酶报告基因实验验证ER[的在其启动子区的结合位点。(5)构建SATB2过表达质粒,转染OVX-BMSCs后分析其干性及成骨分化能力;以OPM动物模型为研究对象,尾静脉注射过表达SATB2的BMSCs至其体内,Micro-CT及HE染色对两组动物模型的四肢骨组织形态学进行分析。结果:(1)成功构建OPM大鼠动物模型,Micro-CT与HE染色发现Sham组大鼠的四肢骨的骨密度、骨小梁数目及体积分数等高于OVX组;Sham-BMSCs的克隆形成率及干性因子Nanog,Sox2,OCT4的表达水平,与OVX-BMSCs组相比升高,具有统计学意义。诱导成骨分化后,与OVX组相比,Sham组的成骨相关基因Runx2,OCN的表达水平高于OVX组,且具有统计学意义。(2)OVX-BMSCs 组加入 10-8M 雌激素后,与 Sham-BMSCs,OVX-BMSCs 进行比较,雌激素干预后,OVX-BMSCs干性及成骨分化能力,均大于OVX-BMSCs组,且SATB2表达水平出现同样高表达趋势。(3)OVX-BMSCs组分别加入siRNA-ERβ,ICI182,780,相较于 OVX-BMSCs 组,siRNA-ER[组的 BMSCs 的干性及成骨分化能力下降,而ICI182,780组的BMSCs的干性及成骨分化能力下降的幅度与siRNA-ER[组一致,且二者之间无统计学意义。SATB2的表达水平在siRNA-ER[,ICI182,780两组中均表达下降,结合SATB2在Sham-BMSCs和OVX-BMSCs组的表达变化,结果表明在雌激素的调控下,SATB2表达水平与ER[密切相关。(4)生物信息学软件在SATB2上游启动子区筛选出三个ERE序列片段(A:-487bp,B:-619bp,C:-1.6kb),构建荧光素酶报告质粒,检测荧光度比值(FL/RL),得出序列A与B有意义。CHIP实验进一步证实ERβ与序列A、B发生结合,并调控SATB2的表达。(5)过表达SATB2病毒载体转入OVX-BMSCs后,细胞克隆形成率增加,干性因子Nanog,Sox2,Oct4的表达水平升高;诱导成骨分化后,钙结节数目增加,成骨相关基因Runx2,OCN的表达水平上调。(6)通过尾静脉注射将过表达的SATB2的BMSCs输入OPM动物模型体内,2月后分离固定大鼠四肢骨,Micro-CT及HE染色分析,结果发现实验组骨密度、骨小梁数目、骨小梁体积等参数均大于对照组。结论:通过体内、体外实验证明ERβ-SATB2通路调节BMSCs的干性及成骨分化能力,参与绝经后骨质疏松的形成过程;SATB2基因修饰BMSCs具有逆转绝经后骨质疏松的有效性和可行性。