研究背景及目的：　　自1911年Beijerinek从土壤中分离出第一株不动杆菌以来，这类广泛分布于自然环境，生存条件简单的革兰阴性菌，已逐渐发展成目前医院内感染的重要条件致病菌之一。鲍曼不动杆菌（Ab）是氧化酶阴性且严格需氧的革兰氏阴性杆菌，其广泛存在于自然界及院内环境中，在一定条件下，鲍曼不动杆菌可引起重症监护病房患者的呼吸机相关性肺炎（VAP）、皮肤和软组织感染、创面感染、泌尿系统感染、继发性脑膜炎和败血症，且某些特殊菌群常导致爆发性的院内感染。随着广谱抗菌药物的广泛使用，临床上关于鲍曼不动杆菌耐药的报道越来越多，并呈现出多重耐药，甚至全耐药及高耐药率的趋势，有报道称近年来碳青霉烯类抗生素的耐药率也明显提高，部分菌株甚至对多粘菌素、替加环素等不常用或新开发抗生素也产生了明显耐药性。因此，临床抗鲍曼不动杆菌感染治疗面临严峻挑战。最近，研究发现蓝光具有极强的杀菌活性：不同于光动力疗法（PDT），其杀菌作用的体现不需要额外光敏感剂，且对正常组织细胞无明显毒性。本文通过体外实验研究蓝光以不同能量作用于鲍曼不动杆菌，并观察分析其杀菌效果，为鲍曼不动杆菌感染的综合治疗提供新的思路。　　研究方法：　　本实验主要通过以下四个方面研究蓝光对鲍曼不动杆菌的杀灭作用：　　1．平板划线评价蓝光杀菌活性：　　无菌条件下，于哥伦比亚琼脂平板两侧各取15ul细菌液划两条平行线，各长4cm；用遮光板遮蔽其中一条平行线（Con组），另一条予以蓝光照射，分组给予不同的能量密度（12 J/cm2，60J/cm2，120 J/cm2和240 J/cm2）（辐射度均为60mw/cm2，根据照射时间（秒）=能量密度/辐射度”，计算不同能量密度所需要的照射时间）；分别于培养12h及24h后进行观察分析菌落的生长情况。本部分实验采用650nm红光作为对照。　　2.菌落计数评价蓝光杀菌活性：　　取1×106 CFU/ml细菌液300ul混匀后加入12孔细胞培养板（COSTAR，USA）中，将上述菌液在3270g、4℃离心10分钟，弃除上清后给予不同的能量密度（同上）的蓝光照射；非处理组（Con组）同样离心处理但不予光照。光照过程中同样将十二孔板置于冰块表面，通风并监测温度；光照完成后，取300ul生理盐水分别加入十二孔板中，吹打混匀后，各取15ul细菌均匀涂在哥伦比亚琼脂培养基表面，置于35℃，CO2培养箱培养24h，观察并拍照，通过Image J软件对菌落计数进行定量分析；每组样本数为6。　　3.杀菌率测定：　　用LIVE/DEAD染色法，定量测定蓝光的杀菌率：菌液前期处理及分组同上，实验组采用蓝光照射，自12J/cm2开始，照射能量的逐步增加，60J/cm2、120J/cm2、240J/cm2，对照组置于自然光下，不予特别光照，光照完成后分别于十二孔板中加入300ul肉汤，于35℃，CO2培养箱培养24h，随后在3270g，4℃离心10分钟，弃除上清，待染色；配置LIVE/DEAD染液（LIVE/DEAD? BacLight?Bacterial Viability Kit for microscopy and quantitative assays，InvitrogenTM︱Molecular Probes?，USA）：取1000ul生理盐水于EP管中，避光条件下分别加入碘化丙啶（propidium iodide）2ul及4-[(2,5-二氯苯基)偶氮]-3-羟基-N-(4-甲基苯基)-2-萘甲酰胺（SYTO）1ul并混匀；将上述染液各取200ul分别加入各组板孔中，避光静置15min，以3270g、4℃离心10min，弃上清；用倒置荧光显微镜（TI-S，Nikon，日本）进行观察、拍照，照片通过Image J软件分析并计算其杀菌率；　　4.蓝光杀生物膜内鲍曼不动杆菌的实验研究：　　1）生物膜的培养及鉴定，将10mm*10mm的盖玻片用洗涤冲净，再用蒸馏水冲洗甩干；用梯度酒精（95％、90%、85%、80%、75%）各浸泡盖玻片半小时，烘干，置于平皿内高温消毒后备用。将经高温消毒的盖玻片置于灭菌的十二孔板三个孔内，取15ul细菌液加入900ul BHI培养液，并混匀，均匀加入上述十二孔板中，盖上盒盖，立即置于培养箱37℃下培养；每间隔48小时换液一次，至培养第七天；去除培养液，加入500ul灭菌水，轻轻晃动约1分钟，吸净灭菌水，如此反复冲洗三次，待染色。2）配置生物膜内菌体染液（FilmTracer? FM?1-43 Green Biofilm Cell Stain︱Molecular Probes?，USA）：取10ul原液加入990ul二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide DMSO）中混匀，取所配溶液100ul加入900ul灭菌水中混匀；各取生物膜内菌体染液及生物膜基质染液(FilmTracer? SYPRO? Ruby Biofilm Matrix Stain，InvitrogenTM︱Molecular Probes?，USA）300ul加入上述待染十二孔板中，避光静置30分钟。取出盖玻片，注意正面朝上，用激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM，Leica TCS SP2，Leica，Germany）观察。每组样本数为6。3）扫描电镜观察蓝光杀生物膜内鲍曼不动杆菌效果及对生物膜的破坏：按以上实验方法培养细菌生物膜至第七天，灭菌水冲洗三次后，待光照。给予本实验最大能量密度360 J/cm2蓝光进行照射，对照组不予任何处理；完成蓝光照射后，各样本加入300ul培养液，置于35℃，CO2培养箱培养24小时。吸除培养液，并用灭菌水冲洗三次，处理加工后于扫描电子显微镜（CM-120Bio Twio，PHILIP，Holland）下观察。每组样本数为6。　　研究结果：　　1.平板划线的大体观察：与Con组相比，自能量密度60J/cm2开始，随着照射能量的增加，蓝光的杀菌效果递增，12J/cm2与Con组相比杀菌效果无明显差异。单独的红光照射并无杀菌效应。　　2.菌落计数的变化：自60J/cm2开始，随着蓝光照射能量的增加，存活的细菌数越来越少（Fig2A）；60 J/cm2、120 J/cm2、240 J/cm2各组平均菌落数（个）分别为（555.33±46.44、16.73±0.58、0.33±0.58），与Con相比（1115.67±97.21），差异显著（P均<0.01），杀菌效果随能量增加而大幅增加，12 J/cm2组与Con组相比，无显著差异（1088.67±137.09，P>0.05）。　　3.杀菌率的变化：通过ImageJ软件分别对活菌及死菌进行定量计数分析发现，12J/cm2组与Con组相比，无显著差异（Con组平均杀菌率0.71%±0.14，12J/cm2组平均杀菌率0.72%±0.11），自60J/cm2开始，随着照射能量的增加，存活的细菌数越来越少；杀菌效果随能量增加而大幅增加，60J/cm2组的平均杀菌率为52.83%±2.16，至240J/cm2组的平均杀菌率已达97.10%±1.54。　　4.蓝光照射后生物膜内鲍曼不动杆菌的变化：经不同能量密度（120 J/cm2，240 J/cm2和360 J/cm2）蓝光照射后，生物膜内鲍曼不动杆菌被不同程度的杀灭（杀菌率分别为53.3%±5.56、93.67%±2.21、97.14%±1.84），且随着能量密度的增加，杀菌效果增强；至能量密度360 J/cm2时，绝大部分鲍曼不动杆菌被杀灭（97.14%±1.84）。同样，电镜结果提示，蓝光在杀灭生物膜内鲍曼不动杆菌的同时，也破坏了细菌生物膜的形成，主要表现在生物膜模型结构的破坏及膜内菌体结构的破坏。　　结论：　　1、与红光相比，蓝光对游离鲍曼不动杆菌具有高效杀灭作用，且有剂量—效应关系。单独的红光照射并无杀菌效应。　　2、蓝光在杀灭生物膜内鲍曼不动杆菌的同时，也破坏了细菌生物膜的形成。