论文部分内容阅读
研究背景及目的: 自1911年Beijerinek从土壤中分离出第一株不动杆菌以来,这类广泛分布于自然环境,生存条件简单的革兰阴性菌,已逐渐发展成目前医院内感染的重要条件致病菌之一。鲍曼不动杆菌(Ab)是氧化酶阴性且严格需氧的革兰氏阴性杆菌,其广泛存在于自然界及院内环境中,在一定条件下,鲍曼不动杆菌可引起重症监护病房患者的呼吸机相关性肺炎(VAP)、皮肤和软组织感染、创面感染、泌尿系统感染、继发性脑膜炎和败血症,且某些特殊菌群常导致爆发性的院内感染。随着广谱抗菌药物的广泛使用,临床上关于鲍曼不动杆菌耐药的报道越来越多,并呈现出多重耐药,甚至全耐药及高耐药率的趋势,有报道称近年来碳青霉烯类抗生素的耐药率也明显提高,部分菌株甚至对多粘菌素、替加环素等不常用或新开发抗生素也产生了明显耐药性。因此,临床抗鲍曼不动杆菌感染治疗面临严峻挑战。最近,研究发现蓝光具有极强的杀菌活性:不同于光动力疗法(PDT),其杀菌作用的体现不需要额外光敏感剂,且对正常组织细胞无明显毒性。本文通过体外实验研究蓝光以不同能量作用于鲍曼不动杆菌,并观察分析其杀菌效果,为鲍曼不动杆菌感染的综合治疗提供新的思路。 研究方法: 本实验主要通过以下四个方面研究蓝光对鲍曼不动杆菌的杀灭作用: 1.平板划线评价蓝光杀菌活性: 无菌条件下,于哥伦比亚琼脂平板两侧各取15ul细菌液划两条平行线,各长4cm;用遮光板遮蔽其中一条平行线(Con组),另一条予以蓝光照射,分组给予不同的能量密度(12 J/cm2,60J/cm2,120 J/cm2和240 J/cm2)(辐射度均为60mw/cm2,根据照射时间(秒)=能量密度/辐射度”,计算不同能量密度所需要的照射时间);分别于培养12h及24h后进行观察分析菌落的生长情况。本部分实验采用650nm红光作为对照。 2.菌落计数评价蓝光杀菌活性: 取1×106 CFU/ml细菌液300ul混匀后加入12孔细胞培养板(COSTAR,USA)中,将上述菌液在3270g、4℃离心10分钟,弃除上清后给予不同的能量密度(同上)的蓝光照射;非处理组(Con组)同样离心处理但不予光照。光照过程中同样将十二孔板置于冰块表面,通风并监测温度;光照完成后,取300ul生理盐水分别加入十二孔板中,吹打混匀后,各取15ul细菌均匀涂在哥伦比亚琼脂培养基表面,置于35℃,CO2培养箱培养24h,观察并拍照,通过Image J软件对菌落计数进行定量分析;每组样本数为6。 3.杀菌率测定: 用LIVE/DEAD染色法,定量测定蓝光的杀菌率:菌液前期处理及分组同上,实验组采用蓝光照射,自12J/cm2开始,照射能量的逐步增加,60J/cm2、120J/cm2、240J/cm2,对照组置于自然光下,不予特别光照,光照完成后分别于十二孔板中加入300ul肉汤,于35℃,CO2培养箱培养24h,随后在3270g,4℃离心10分钟,弃除上清,待染色;配置LIVE/DEAD染液(LIVE/DEAD? BacLight?Bacterial Viability Kit for microscopy and quantitative assays,InvitrogenTM︱Molecular Probes?,USA):取1000ul生理盐水于EP管中,避光条件下分别加入碘化丙啶(propidium iodide)2ul及4-[(2,5-二氯苯基)偶氮]-3-羟基-N-(4-甲基苯基)-2-萘甲酰胺(SYTO)1ul并混匀;将上述染液各取200ul分别加入各组板孔中,避光静置15min,以3270g、4℃离心10min,弃上清;用倒置荧光显微镜(TI-S,Nikon,日本)进行观察、拍照,照片通过Image J软件分析并计算其杀菌率; 4.蓝光杀生物膜内鲍曼不动杆菌的实验研究: 1)生物膜的培养及鉴定,将10mm*10mm的盖玻片用洗涤冲净,再用蒸馏水冲洗甩干;用梯度酒精(95%、90%、85%、80%、75%)各浸泡盖玻片半小时,烘干,置于平皿内高温消毒后备用。将经高温消毒的盖玻片置于灭菌的十二孔板三个孔内,取15ul细菌液加入900ul BHI培养液,并混匀,均匀加入上述十二孔板中,盖上盒盖,立即置于培养箱37℃下培养;每间隔48小时换液一次,至培养第七天;去除培养液,加入500ul灭菌水,轻轻晃动约1分钟,吸净灭菌水,如此反复冲洗三次,待染色。2)配置生物膜内菌体染液(FilmTracer? FM?1-43 Green Biofilm Cell Stain︱Molecular Probes?,USA):取10ul原液加入990ul二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide DMSO)中混匀,取所配溶液100ul加入900ul灭菌水中混匀;各取生物膜内菌体染液及生物膜基质染液(FilmTracer? SYPRO? Ruby Biofilm Matrix Stain,InvitrogenTM︱Molecular Probes?,USA)300ul加入上述待染十二孔板中,避光静置30分钟。取出盖玻片,注意正面朝上,用激光共聚焦扫描显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM,Leica TCS SP2,Leica,Germany)观察。每组样本数为6。3)扫描电镜观察蓝光杀生物膜内鲍曼不动杆菌效果及对生物膜的破坏:按以上实验方法培养细菌生物膜至第七天,灭菌水冲洗三次后,待光照。给予本实验最大能量密度360 J/cm2蓝光进行照射,对照组不予任何处理;完成蓝光照射后,各样本加入300ul培养液,置于35℃,CO2培养箱培养24小时。吸除培养液,并用灭菌水冲洗三次,处理加工后于扫描电子显微镜(CM-120Bio Twio,PHILIP,Holland)下观察。每组样本数为6。 研究结果: 1.平板划线的大体观察:与Con组相比,自能量密度60J/cm2开始,随着照射能量的增加,蓝光的杀菌效果递增,12J/cm2与Con组相比杀菌效果无明显差异。单独的红光照射并无杀菌效应。 2.菌落计数的变化:自60J/cm2开始,随着蓝光照射能量的增加,存活的细菌数越来越少(Fig2A);60 J/cm2、120 J/cm2、240 J/cm2各组平均菌落数(个)分别为(555.33±46.44、16.73±0.58、0.33±0.58),与Con相比(1115.67±97.21),差异显著(P均<0.01),杀菌效果随能量增加而大幅增加,12 J/cm2组与Con组相比,无显著差异(1088.67±137.09,P>0.05)。 3.杀菌率的变化:通过ImageJ软件分别对活菌及死菌进行定量计数分析发现,12J/cm2组与Con组相比,无显著差异(Con组平均杀菌率0.71%±0.14,12J/cm2组平均杀菌率0.72%±0.11),自60J/cm2开始,随着照射能量的增加,存活的细菌数越来越少;杀菌效果随能量增加而大幅增加,60J/cm2组的平均杀菌率为52.83%±2.16,至240J/cm2组的平均杀菌率已达97.10%±1.54。 4.蓝光照射后生物膜内鲍曼不动杆菌的变化:经不同能量密度(120 J/cm2,240 J/cm2和360 J/cm2)蓝光照射后,生物膜内鲍曼不动杆菌被不同程度的杀灭(杀菌率分别为53.3%±5.56、93.67%±2.21、97.14%±1.84),且随着能量密度的增加,杀菌效果增强;至能量密度360 J/cm2时,绝大部分鲍曼不动杆菌被杀灭(97.14%±1.84)。同样,电镜结果提示,蓝光在杀灭生物膜内鲍曼不动杆菌的同时,也破坏了细菌生物膜的形成,主要表现在生物膜模型结构的破坏及膜内菌体结构的破坏。 结论: 1、与红光相比,蓝光对游离鲍曼不动杆菌具有高效杀灭作用,且有剂量—效应关系。单独的红光照射并无杀菌效应。 2、蓝光在杀灭生物膜内鲍曼不动杆菌的同时,也破坏了细菌生物膜的形成。