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目的借助生物信息学和网络药理学技术,构建荣筋拈痛方对骨关节炎软骨退变的靶点网络,阐述荣筋拈痛方调节骨关节炎软骨退变的可能作用途径;根据前述结果,确定有效通路用于后续骨关节炎的动物和细胞实验,为荣筋拈痛方的临床应用提供实验依据。方法1.检索TCMSP、BATMAN-TCM、ETCM数据库,收集荣筋拈痛方中药化合物结合靶点。通过GEO数据库检索出骨关节炎大鼠软骨的芯片数据集,R语言分析出差异表达基因,再通过DAVID、STRING数据库进行富集分析和PPI分析。韦恩图分析获得荣筋拈痛方中药化合物结合靶点与骨关节炎软骨退变差异基因的合集指标,在STRING数据库进行合集指标的PPI分析及富集分析。综合生物信息学和网络药理学结果,结合现有文献报道,确定后续实验研究方向。2.8周龄SPF级SD雄性大鼠40只,改良Hulth法建立大鼠膝骨关节炎模型,随机数字表法将实验大鼠分为空白组、模型组、治疗组和对照组。空白组和模型组予生理盐水灌胃,治疗组予荣筋拈痛方水提液灌胃,对照组予盐酸氨基葡萄糖胶囊灌胃,干预时间为12周。干预后,大体观察各组大鼠胫骨平台软骨组织的解剖学形态,光学显微镜观察软骨组织显微形态结构变化,电子显微镜观察软骨组织超微形态结构变化,ELISA检测滑膜SDF-1含量,免疫组化法检测软骨CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白的表达,Western blot检测软骨P38、ERK1/2、JNK磷酸化蛋白的表达。3.4周龄SPF级SD雄性大鼠30只,用机械-Ⅱ型胶原酶消化法分批提取软骨细胞。Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行功能鉴定,建立大鼠软骨细胞体外培养。选择第二代软骨细胞进行后续实验,ELISA检测法确定SDF-1诱导软骨细胞的干预剂量和时间,确定荣筋拈痛方干预浓度。将软骨细胞随机分为空白组、模型组(SDF-1)、荣筋拈痛方组(SDF-1+荣筋拈痛方)、抑制剂组(SDF-1+AMD3100)。干预后,激光共聚焦显微镜观察软骨细胞CXCR4蛋白表达,Western blot检测软骨细胞中CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白和P38、ERK1/2、JNK磷酸化蛋白的表达。结果1.TCMSP、BATMAN-TCM、ETCM三大数据库检索得到1787个荣筋拈痛方中药化合物结合靶点。骨关节炎大鼠软骨中差异表达基因共226个(其中167个基因上调、59个基因下调),PPI网络图中关键基因有CXCR4、CCL2、CD44、IGF1、COL1A1等,软骨退变机制可能和ECM与受体相互作用、细胞因子与细胞因子受体作用、趋化因子信号通路等途径失调有关。荣筋拈痛方作用于骨关节炎软骨退变的靶点指标有42个,包括CXCR4、CCL2等。荣筋拈痛方通过包括SDF-1/CXCR4信号轴在内的细胞因子与细胞因子受体的相互作用、MAPK信号通路等途径作用于骨关节炎软骨退变。2.动物实验中,大体观察显示,空白组大鼠软骨表面光滑,呈粉色且有光泽,模型组大鼠软骨色泽失常、软骨缺损、骨赘增多,治疗组和对照组大鼠软骨解剖形态和色泽介于空白组和模型组之间。光镜观察显示,空白组大鼠软骨表面光滑平整,软骨细胞未见紊乱表现,基质染色均匀、未失染;模型组大鼠软骨表面毛糙、有裂隙,软骨细胞成簇状分布且有肥大分化现象,基质失染严重;治疗组和对照组大鼠软骨表面稍不平整,部分软骨细胞成簇状分布表现,基质染色不均匀、轻微失染。电镜观察显示,空白组大鼠软骨细胞结构较完整,胶原纤维细密;模型组大鼠软骨细胞发生病变,细胞器数量减少,内质网蛋白合成功能异常,胶原纤维较粗且疏松;治疗组和对照组大鼠软骨细胞和胶原纤维的形态结构介于空白组和模型组之间。ELISA、免疫组化和Western blot结果显示,模型组SDF-1、CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白以及P38、ERK1/2磷酸化蛋白的表达高于空白组(P<0.05或P<0.01),治疗组和对照组低于模型组(P<0.05或P<0.01)。3.细胞实验中,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色和甲苯胺蓝染色观察显示,提取的细胞胞浆呈棕黄色和蓝紫色,具有软骨细胞的典型特征。ELISA结果显示,SDF-1诱导软骨细胞的有效浓度和时间为100 ng/m L、12 h,荣筋拈痛方有效干预浓度为300μg/m L。激光共聚焦显微镜观察结果显示,模型组CXCR4荧光强度高于空白组,荣筋拈痛方组和抑制剂组CXCR4荧光强度低于模型组。Western blot结果显示,模型组CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白以及P38磷酸化蛋白的表达高于空白组(P<0.05或P<0.01),荣筋拈痛方组和抑制剂组低于模型组(P<0.05或P<0.01)。结论1.荣筋拈痛方对骨关节炎软骨退变的作用机制与炎症反应相关,其对骨关节炎软骨退变的调节作用切合骨关节炎软骨病理机制,可通过SDF-1/CXCR4信号轴和MAPK通路作用于骨关节炎软骨退变。2.荣筋拈痛方能改善膝骨关节炎大鼠软骨组织形态结构,抑制滑膜SDF-1和软骨CXCR4蛋白表达,下调MAPK通路中P38、ERK1/2磷酸化蛋白表达,降低MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白表达,达到延缓膝骨关节炎大鼠软骨退变的作用。3.荣筋拈痛方干预SDF-1诱导的体外软骨细胞后,下调CXCR4蛋白及MAPK通路中P38磷酸化蛋白表达,减少软骨细胞MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白的合成,达到延缓骨关节炎软骨退变的作用。