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第一部分 南京地区淋球菌抗生素耐药情况分析目的：监测南京地区淋球菌对抗生素的敏感性,分析2013至2014年度淋球菌耐药情况。方法：连续招募2013-2014年间就诊于南京性病门诊具有急性尿道炎症状的男性患者,并进行淋球菌分离培养。对培养阳性的384株淋球菌以琼脂稀释法测定青霉素、四环素、环丙沙星、大观霉素、头孢克肟、头孢曲松及阿奇霉素对淋球菌的最小抑菌浓度(MIC)。采用酸度纸片法测定产青霉素酶淋球菌(PPNG),以多重聚合酶链反应(PCR)法对PPNG和四环素高度耐药淋球菌(TRNG)所携带的耐药质粒进行分型,并对PPNG菌株进行blaTEM基因检测。结果：本研究中淋球菌对抗生素耐药率依次为环丙沙星100%(384/384)、四环素85.9%(330/384)、青霉素72.1%(277/384)、阿奇霉素32.3%(124/384)。阿奇霉素高度耐药菌株比例为10.4%(40/384),头孢曲松低敏菌株比例为9.9%(38/384)。未发现大观霉素、头孢克肟和头孢曲松耐药株。在全部菌株中,PPNG占46.9%(180/384),TRNG比例为34.6%(133/384)。PPNG主要携带亚洲型质粒(73.3%,132/180),非洲型质粒比例(26.7%,48/180)较2011-2012年度(10.0%,12/120)呈显著性上升(X2=12.500,P<0.001)。TRNG的主要质粒型别为荷兰型(91.7%,122/133)。41.1%(74/180)的PPNG中含有blaTEM-135基因。结论：头孢曲松和大观霉素仍可作为本地区淋球菌治疗的一线用药,但头孢曲松低敏株的增多、大观霉素MIC呈上升趋势均提示应继续加强淋球菌耐药性监测。阿奇霉素高度耐药淋球菌在南京地区出现,且占有较高比例,提示本地区不宜推荐头孢曲松和阿奇霉素联合治疗淋球菌感染。南京地区淋球菌质粒介导的耐药比例和TRNG质粒型别分布与上一年度相比无显著变化,但携带非洲型质粒PPNG的比例上升提示可能存在菌株间的跨洲际交流。本地区PPNG中blaTEM-135基因以高比例存在。第二部分 耐阿奇霉素淋球菌的耐药机制和分子流行病学研究目的：了解南京地区阿奇霉素耐药淋球菌菌株的耐药相关基因突变情况、基因型别及菌株间的进化关系。方法：对124株阿奇霉素耐药菌株进行耐药相关基因(23S rRNA、mtrR、rplD、rplV)检测,并比较耐药基因突变在中度耐药组(MIC 1～64 mg/L)和高度耐药组(MIC≥256mg/L)间的差异。以淋球菌多抗原序列分型(NG-MAST)方法确立菌株的序列型(ST),并构建系统进化树。结果：所有阿奇霉素高度耐药菌株均出现23 S rRNA基因4个等位基因的A2143G突变,中度耐药组中59.5%(50/84)出现该基因4个等位基因的C2599T突变,两组间比较均有显著性差异。mtrR编码区G45D替换突变在高度耐药组比例分别为70.0%(28/40),与中度耐药组(13.1%,11/84)相比有显著性差异(x2=40.698,P<0.001)；H105Y突变在高度耐药组和中度耐药组的比例分别为22.5%(9/40)和71.4%(60/84),两组间有显著性差异(x2=26.283,P<0.001)。所有菌株均未检出rplD和rp1V突变。124株阿奇霉素耐药菌株共鉴定出71个不同的STs,其中28个为新发现的STs；高度耐药组中45.0%(18/40)的序列型为ST1866。经系统进化树分析未发现阿奇霉素耐药与头孢曲松低敏菌株同源进化现象。结论：23S rRNA基因V区的特定位点等位基因突变在阿奇霉素耐药中发挥重要作用,A2143G和C2599T突变分别与阿奇霉素高度和中度耐药相关。mtrR编码区G45D替换突变可能参与阿奇霉素高度耐药,而H105Y替换突变可能与中度耐药有关。南京地区的阿奇霉素耐药菌株具有遗传背景的多样性。ST1866是本地区与阿奇霉素高度耐药相关的优势基因型。第三部分头孢曲松低敏淋球菌的耐药机制和分子流行病学研究目的：了解南京地区头孢曲松低敏淋球菌菌株的耐药相关基因突变情况、基因型别及菌株间的进化关系。方法：对38株头孢曲松低敏株(MIC 0.125mg/L)进行5个耐药相关基因(penA、mtrR、 porB、ponA和pilQ)检测,并将20株头孢曲松敏感株(MIC≤0.002-0.015mg/L)设为对照组。以NG-MAST方法确立菌株的ST,并构建系统进化树。结果：本研究共检测出11种非镶嵌状PBP2类型,并发现一种新的类型XLⅡ；未检出镶嵌状模式。头孢曲松低敏组PBP2主要类型为ⅩⅧ (n=17)和ⅩⅢ(n=16)。头孢曲松低敏组100%发生A501位点(A501V/T)突变,而头孢曲松敏感组20.0%(4/20)出现该位点突变,两组间比较有显著性差异(x2=41.981,P<0.001)。mtrR启动子区A缺失与编码区H105Y联合突变率在头孢曲松低敏组和敏感组分别为63.2%(24/38)和30.0%(6/20),两组间比较有显著性差异(x2=5.770,P=0.016)。mtrR编码区其他替换(A39T、G45D)、porB1b及ponA (L421P)突变率在两组间未见显著性差异。所有菌株均未检出pilQ突变。经NG-MAST分型和系统进化树分析,头孢曲松低敏菌株间未出现克隆传播现象。结论：特定的非镶嵌状penA突变模式(特别是PBP2氨基酸A501位点突变)可能在介导本地区淋球菌对头孢曲松低敏中发挥重要作用。mtrR基因启动子区单碱基(A)缺失和编码区H105Y替换突变可能参与了头孢曲松敏感性下降。