研究背景与目的:鼻咽癌（NPC）是我国南方常见的恶性肿瘤之一，是一种遗传和环境因素共同作用的多基因遗传性肿瘤。通过大量对鼻咽癌的研究，发现细胞的恶性转化和转移复发受多基因调控，因此多基因联合治疗对于控制鼻咽癌的转移复发有重要的意义。该国家自然基金项目的总体目标就是建立多基因联合干预鼻咽癌转移复发的技术平台，本论文为该目标的前期工作，即构建人工TALEN核酸酶与基因打靶载体。　　基因打靶技术是近几十年新兴的遗传操作手段，已被证明是目前精确修饰基因组的最有效方法之一。至今，该技术引起了人们广泛的关注并逐渐走向成熟，为基因治疗疾病掀开了新的一面。然而，传统的基因打靶发生同源重组事件的概率仅仅是10-6-10-5之间。为了解决利用基因打靶技术使基因治疗在临床应用过程中所面临的问题，课题组前期已建立锌指核酸酶（ZFNs）与以rDNA间隔序列作为靶位点的多位点基因打靶相结合的新型技术，并证明该技术能有效的提高定点整合率和外源基因的稳定表达。　　最近，类转录激活因子样效应因子核酸酶（TALENs）由于其定点插入效率高、细胞毒性低的特点引起了人们的注意。TALENs主要包含两个结构域，分别是DNA识别结构域TALE蛋白和由非特异核酸内切酶FokⅠ组成的DNA切割结构域。与ZFNs对基因组DNA的切割机制一样，TALENs是由两个单体以尾对尾的方式通过TALE蛋白特异性结合到靶DNA后，非特异性内切酶FokⅠ形成二聚体切割靶DNA序列的，造成靶序列DNA双链断裂（DSB）。在同源臂DNA模板存在下，DSB被同源重组（HR）介导的修复机制准确的修复。因此，我们利用TALENs技术与多位点打靶技术相结合，将有效提高基因定点插入效率。　　本文拟构建人基因组rDNA基因序列上的TALENs真核表达载体，并通过细胞转染及基因测序筛选出最高切割活性的一对TALENs。同时，采用基因克隆技术构建人类通用构建多位点打靶载体。TALENs和多位点打靶技术的结合，是一种有效基因组编辑新技术，将为鼻咽癌转移复发的多基因调控建立关键技术并提供重要材料。　　方法:　　一、运用在线软件在人基因组rDNA基因序列上寻找到合适的TALENs切割位点，利用TALENs单体和骨架质粒库，构建5条TALENs真核表达载体，并通过酶切、测序比对加以验证。TALENs载体经配对，以最优转染体系条件转染HEK-293T细胞，经适当浓度的嘌呤霉素筛选4 d后提取基因组DNA，PCR扩增靶序列，经测序峰图判断TALENs活性，并选出切割活性最高的一对TALENs。经PCR产物克隆pMD19-T载体后，挑取25-30个质粒进行测序，质粒测序结果经比对，判断该对TALENs对靶位点的切割活性。　　二、以TALENs切割位点为靶位点构建人类细胞通用多位点基因打靶载体。该打靶载体包含左右同源重组引导序列DS1和DS2（TALENs切割位点两侧基因序列）以及标记蛋白表达元件。采用基因克隆方法将DS1、DS2、标记蛋白表达元件克隆至pUC-19载体中。最终，经酶切、测序以及将载体转染到293T细胞观察是否表达得到验证。　　结果:　　一、5条TALENs真核表达载体经酶切证实片段大小与预期一致，测序结果经过氨基酸比对该载体与片段完全匹配，成功构建5条TALENs真核表达载体。其中两条为TALENs左臂L1、L2，三条为TALENs右臂R1、R2、R3。将不同配伍的TALENs转染293T细胞后，根据基因测序峰图发现TALENs-L1R2峰图出现明显套峰，经质粒测序结果比对，发现TALENs-L1R2对靶位点的切割活性可达78.5％。　　二、重组质粒pUC-DS1-EGFP-DS2经酶切及菌液PCR验证该插入片段大小与预期一致，测序结果显示该插入片段与目的片段匹配，成功构建多位点打靶载体pUC-DS1-EGFP-DS2；经细胞转染验证，证明pUC-DS1-EGFP-DS2中绿色荧光能在细胞中表达。　　结论:　　一、成功设计、构建5条TALENs真核表达载体，并得到切割活性最高的TALENs-L1R2。　　二、成功构建人类通用多位点打靶载体pUC-DS1-EGFP-DS2，并证明其在HEK-293T细胞中能够表达绿色荧光蛋白。