牙周炎(periodontitis)作为口腔健康的头号杀手,主要由菌斑引起的直接细胞毒作用及宿主对菌斑微生物的免疫应答导致牙周组织损伤,进一步引起牙周支持组织丧失,导致牙齿缺失。越来越多的研究证实在牙周炎发生发展过程中存在多种mi RNAs的表达变化,提示它们在牙周炎发生发展中发挥着重要的作用。然而,其究竟通过何种途径来影响牙周炎的发生发展过程,尚需大量研究证实。吸烟作为牙周炎重要的危险因素,烟草中的主要成分尼古丁在牙周炎发生发展过程中发挥着重要作用。课题组前期研究通过构建牙周炎大鼠模型、体外培养人牙周膜细胞,尼古丁作用于实验性牙周炎大鼠和人牙周膜细胞后,发现烟碱型乙酰胆碱受体α7亚型(alpha7 nicotinic acetylcholine receptor,α7 n ACh R)在实验性牙周炎大鼠牙周组织和和人牙周膜细胞的表达均显著升高,α7 n ACh R特异性拮抗剂α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BTX)可拮抗该效应,进而参与吸烟相关性牙周炎发生发展过程。另有研究表明,尼古丁、α7 n ACh R可能通过调控多种mi RNAs表达水平,参与多种心血管系统、神经系统疾病的发生发展过程。然而关于尼古丁、α7 n ACh R调控mi RNAs参与牙周疾病乃至口腔疾病发生发展的研究却鲜有报道。由此,我们猜想:尼古丁激活人牙周膜细胞α7 n ACh R后可能会通过mi RNAs进一步参与吸烟促牙周组织炎性损伤和抑制牙周组织修复过程。但是其具体分子机制尚需进一步研究。本研究将深入探讨mi RNAs在吸烟相关性牙周炎发生发展中发挥的作用,为牙周炎的防治提供新的理论依据和治疗靶点。【目的】【目的】本课题拟从尼古丁调控牙周膜细胞周期进程、细胞增殖、STAT3信号通路等方面入手,系统探讨尼古丁可能通过调控牙周膜细胞mi R-30a表达水平,进而调节NF-κB-mi R-30a-STAT3反馈环路和CCNE2参与牙周组织炎性损伤和组织修复过程的机制;探索基于mi R-30a调节途径出发降低尼古丁促牙周炎患者的牙周组织损伤和抑制牙周组织修复效应,为有效预防及治疗吸烟相关性牙周炎提供新的理论依据。【方法】1.组织块法进行牙周膜细胞原代培养;在成功培养原代牙周膜细胞后进行常规传代。流式细胞实验鉴定细胞表型;待牙周膜细胞传至第五代时,给予细胞尼古丁处理,micro RNA芯片检测尼古丁处理后牙周膜细胞mi RNAs表达情况,选取与细胞增殖和炎性反应密切相关的mi RNAs进行q PCR验证,考虑到mi R-30家族成员成熟形式差异较小,故通过扩增其前体形式来比较表达差异。2.分别给予第5代牙周膜细胞10-5M尼古丁和/或10-8Mα-BTX和/或mi R-30a inhibitor处理;MTT实验检测各组细胞增殖情况,流式细胞实验分析各组细胞周期分布情况,实时定量PCR检测各组牙周膜细胞mi R-30a表达情况,实时定量PCR和Western blot实验检测各组细胞CCNE2的m RNA和蛋白表达情况。构建CCNE2 3’UTR野生型和突变型报告基因载体,双荧光素酶报告基因实验验证mi R-30a是否可以直接结合CCNE2 3’UTR区;设计CCNE2干扰RNA,验证CCNE2在调节牙周膜细胞增殖和细胞周期中的作用。3.分别给予第5代牙周膜细胞10-5M尼古丁和/或10-8Mα-BTX和/或mi R-30a inhibitor处理;采用实时定量PCR和Western blot实验检测各组细胞SOCS3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性因子m RNA和蛋白表达情况,双荧光素酶报告基因实验检测尼古丁对STAT3活性水平的影响。构建SOCS3 3’UTR野生型和突变型报告基因载体,双荧光素酶报告基因实验验证mi R-30a是否可以直接结合SOCS3 3’UTR区;设计SOCS3干扰RNA,验证SOCS3在调节牙周膜细胞JAK2-STAT3信号通路中的作用。4.尼古丁可显著上调pre-mi R-30a表达,提示尼古丁对mi R-30a的抑制作用可能发生于转录起始水平。因而,我们对mi R-30a的潜在宿主基因进行分析,发现mi R-30a宿主基因的启动子区存在转录因子NF-κB的结合位点。分别给予第5代牙周膜细胞10-5M尼古丁和/或拮抗剂10-8Mα-BTX和/或5x10-5M PDTC和/或10-6M Cucurbitacin I处理;采用实时定量PCR检测各组细胞mi R-30a表达水平,Western blot实验和双荧光素酶报告基因实验检测各组细胞NF-κB p65蛋白表达水平和NF-κB活性水平。【结果】1.体外成功进行人牙周膜细胞原代培养。待细胞聚合生长至90%时,常规进行细胞传代,流式细胞实验发现细胞表面高表达间充质细胞表型CD29、CD105,低表达细胞表型CD31、CD14,提示细胞来源于间充质;给予第5代牙周膜细胞尼古丁作用后进行micro RNA芯片检测,发现有20个micro RNAs上调;16个micro RNAs下调;选择与炎性反应和细胞增殖密切相关的mi R-30a、let-7f、mi R-21及let-7e进行实时定量PCR验证,发现10-5M尼古丁可显著上调牙周膜细胞pre-mi R-30a表达水平,且呈时间依赖性;而let-7f、mi R-21及let-7e表达水平无明显规律,故最终确定mi R-30a进行深入研究。2.尼古丁可抑制牙周膜细胞增殖能力,转染mi R-30a inhibitor可逆转尼古丁对牙周膜细胞增殖能力的抑制效应,差异有统计学意义;另外,尼古丁可抑制牙周膜细胞周期蛋白CCNE2表达,诱导牙周膜细胞发生G1期阻滞,导致其合成DNA能力下降,进而影响其增殖过程。给予人牙周膜细胞转染mi R-30a inhibitor可干扰牙周膜细胞内mi R-30a的表达;进一步研究发现,抑制mi R-30a的表达可调节尼古丁影响的牙周膜细胞CCNE2表达水平,削弱尼古丁抑制的牙周膜细胞周期进程;双荧光素酶报告基因实验证实mi R-30a可直接结合CCNE2 3’UTR区,调控其表达水平;干扰CCNE2表达后,发现CCNE2是调控牙周膜细胞G1期向S期转化的关键因子,进而影响其增殖能力。3.尼古丁可激活牙周膜细胞JAK2-STAT3信号通路,参与牙周组织炎性反应过程,表现为:尼古丁可明显上调磷酸化的JAK2和STAT3蛋白表达水平和STAT3活性水平。对STAT3抑制剂Cucurbitacin I进行浓度梯度实验发现,10-5M和10-6MCucurbitacin I均可抑制磷酸化STAT3蛋白表达水平,而10-5M Cucurbitacin I细胞毒性较大,细胞坏死较多,而10-7M Cucurbitacin I抑制STAT3能力较低,故选择10-6M Cucurbitacin I作为后续的实验浓度。另外,尼古丁激活JAK2-STAT3信号通路后,还可上调下游炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α表达水平,10-6M Cucurbitacin I可拮抗尼古丁的激活效应,提示尼古丁可通过JAK2-STAT3参与吸烟相关性牙周炎炎性损伤过程。进一步研究发现,抑制mi R-30a的表达可调节尼古丁对JAK2-STAT3信号通路的激活效应,削弱尼古丁诱导的牙周组织炎性反应过程;双荧光素酶报告基因实验证实mi R-30a可直接结合SOCS3 3’UTR区,调控其表达水平;干扰SOCS3表达后,发现SOCS3是调控牙周膜细胞JAK2-STAT3信号通路激活与否的关键因子。4.Western blot和双荧光素酶报告基因实验证实尼古丁可激活牙周膜细胞NF-κB信号通路;另外,对mi R-30a宿主基因转录起始位点上游5000bp至下游1000bp的DNA区域的分析表明,在该区域里存在NF-κB结合位点;当PDTC抑制NF-κB表达后,mi R-30a的表达水平也受到抑制,提示NF-κB可能通过调控mi R-30a的启动子区影响其表达水平。而STAT3信号通路抑制剂Cucurbitacin I也能下调p65蛋白表达和NF-κB活性水平,进而构成NF-κB-mi R-30a-STAT3反馈环路参与牙周组织炎性损伤过程。【结论】1.成功培养鉴定人牙周膜细胞,micro RNA芯片和实时定量PCR实验结果发现尼古丁可能通过上调mi R-30a表达水平参与吸烟相关性牙周炎发生发展过程。2.尼古丁可通过上调人牙周膜细胞mi R-30a表达水平,来靶向下调CCNE2表达水平,促进牙周膜细胞发生G1期阻滞,进而抑制牙周膜细胞增殖能力,参与吸烟抑制牙周组织修复过程。3.尼古丁通过上调人牙周膜细胞mi R-30a表达水平,来靶向下调SOCS3表达水平,解除其对牙周膜细胞STAT3信号通路的抑制作用,导致牙周膜细胞STAT3信号通路的持续激活,进而参与吸烟促进牙周组织炎性损伤过程。4.尼古丁可能通过调节NF-κB活性水平来调控牙周膜细胞mi R-30a表达;STAT3又能反馈调控NF-κB活性水平,从而构成一个NF-κB-mi R-30a-STAT3反馈环路,参与吸烟相关性牙周炎牙周组织炎性损伤过程。