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研究背景表皮生长因子-酪氨酸激酶抑制剂(Epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI)开启了非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)个体化治疗时代,已经成为EGFR突变阳性的晚期NSCLC一线标准治疗。然而不可避免地是,在EGFR-TKI治疗NSCLC的过程中均出现获得性耐药。EGFR-TKI获得性耐药后NSCLC的治疗策略选择尤为重要。放射治疗作为EGFR-TKI获得性耐药后NSCLC的局部治疗重要选择之一,在后续治疗中发挥着重要作用。有临床研究表明:放疗作为EGFR-TKI耐药后NSCLC的治疗策略能延长患者的生存时间。但放疗抗拒是制约放疗疗效的重要原因。EGFR-TKI获得性耐药后NSCLC对放疗敏感性如何?目前针对EGFR-TKI获得性耐药后NSCLC放疗疗效的预测尚缺乏有效相关指标。既往研究显示,上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是EGFR-TKI获得性耐药的重要机制之一,在临床研究发现EMT阳性患者放化疗效果差,而基础研究表明EMT不仅与肿瘤的侵袭、远处转移,还与肿瘤放疗抗拒密切相关。为此,我们提出科学假设:EMT状态对NSCLC获得性耐药后放射敏感性存在影响,可能是EGFR-TKI获得性耐药后预测放疗敏感性的有效指标。研究方法本研究选用EGFR19外显子缺失突变的人肺腺癌细胞PC-9及对吉非替尼产生获得性耐药的PC-9/AB细胞株。按以下方法进行实验研究:1、采用PCR技术检测PC-9和PC-9/AB细胞EGFR基因突变情况,FISH法检测c-Met基因扩增情况;用细胞增殖/毒性实验(CCK8法)检测两组细胞对吉非替尼的敏感性;2、比较PC-9和PC-9/AB细胞的放射敏感性:采用CCK8法检测不同剂量X射线照射之后两组细胞的相对细胞存活数、平板克隆实验检测不同剂量X射线照射之后其克隆成形能力,以及流式细胞术检测4Gy剂量X射线照射之后细胞凋亡情况,对比两组细胞对X射线的敏感性;3、采用免疫印迹法(Western Blotting)检测两组细胞中EMT相关蛋白E-cadherin、Vementin和EMT相关转录因子Snail等表达水平,同时观察细胞形态学的变化,确定细胞株的EMT状态;再通过划痕愈合实验检测两组细胞的迁移能力;初步探讨伴EMT的获得性耐药是否影响其放射敏感性的原因;4、通过TGF-β1诱导PC-9细胞后获得PC-9/TGF细胞;检测EGFR基因突变情况和c-Met基因扩增情况;Western Blot检测发生EMT情况,以及划痕愈合实验检测细胞迁移能力变化情况;CCK8法检测对吉非替尼敏感性。再比较PC-9、PC-9/TGF和PC-9/AB三组细胞的放射敏感性:采用CCK8法检测不同剂量X射线照射之后三组细胞的相对细胞存活数、平板克隆实验检测不同剂量X射线照射之后克隆成形能力,以及流式细胞术检测4Gy剂量X射线照射之后细胞凋亡情况,进行多重比较,来对比三组细胞对X射线的敏感性,从正方向验证EMT与NSCLC细胞EGFR-TKI获得性耐药后放射敏感性相关;5、采用慢病毒转染技术将PC-9/AB细胞转染CDH1基因后获得PC-9/AB-CDH1细胞;检测EGFR基因突变情况和c-Met基因扩增情况;Western Blot检测逆转EMT情况,以及划痕愈合实验检测细胞迁移能力变化情况;CCK8法检测对吉非替尼敏感性。再比较PC-9/AB细胞和PC-9/AB-CDH1细胞的放射敏感性:采用CCK8法检测不同剂量X射线照射之后两组细胞的相对细胞存活数、平板克隆实验检测不同剂量X射线照射之后其克隆成形能力,以及流式细胞术检测4Gy剂量X射线照射之后细胞凋亡情况,来对比两组细胞对X射线的敏感性,从反方向验证EMT在NSCLC细胞EGFR-TKI获得性耐药后放射敏感性的关系。研究结果1、经检测PC-9和PC-9/AB细胞均为EGFR基因19外显子突变,18、20、21外显子无突变,无T790m突变,无c-Met扩增。对两组细胞进行了吉非替尼的敏感性检测,结果显示:人肺腺癌细胞株PC-9/AB细胞对吉非替尼的敏感性明显低于亲本细胞株PC-9,IC50分别为9.68μmol/L和0.06μmol/L(P<0.01);2、获得性耐药的PC-9/AB细胞放射敏感性较PC-9显著降低:随着照射剂量的增加,PC-9和PC-9/AB细胞相对细胞存活数均逐渐减少。PC-9/AB细胞在4Gy、6Gy、8Gy、10Gy剂量组相对细胞存活数均明显高于PC-9细胞(P<0.05);PC-9/AB细胞在2Gy、4Gy、6Gy、8Gy剂量组克隆成形率高于PC-9(P<0.05);在4Gy剂量照射下,PC-9/AB细胞凋亡率低于PC-9,凋亡率分别为(14.80±1.06)%VS(30.52±2.76)%(P<0.05);3、与PC-9相比,PC-9/AB细胞出现EMT表型,表现为PC-9/AB细胞生物学形态发生明显改变,细胞间连接变疏松,细胞出现梭形改变,即由上皮细胞形态向间质细胞形态转变;PC-9/AB上皮型标记蛋白E-Cadherin表达减少,间叶型标记蛋白Vimentin表达增加,与EMT相关转录因子Snail表达增加,PC-9/AB细胞较PC-9划痕愈合率明显提高,24h愈合率从(33.47±1.38)%提高至(53.23±2.18)%,48h愈合率从(49.84±0.78)%提高至(83.88%±3.35)%,迁移能力明显增强;4、TGF-β1诱导产生的细胞株PC-9/TGF细胞基因检测为EGFR基因19外显子突变,18、20、21外显子无突变,无T790m突变,无c-Met扩增。相对于PC-9细胞,PC-9/TGF细胞出现EMT表型,表现为PC-9/TGF细胞间连接变疏松,细胞呈梭形,即由上皮细胞形态向间质细胞形态转变,PC-9/TGF细胞的上皮型标记蛋白E-Cadherin表达减少,间叶型标记蛋白Vimentin表达增加,与EMT相关转录因子Snail表达增加;PC-9/TGF细胞较PC-9划痕愈合率明显提高,24h愈合率从(33.47±1.38)%提高至(51.05±1.34)%,48h愈合率从(49.84±0.78)%提高至(80.50±3.23)%,其迁移能力显著增强;PC-9/TGF细胞对吉非替尼的敏感性较PC-9显著降低,IC50值为6.21μmol/L和0.06μmol/L(P<0.01);5、诱导出现EMT的PC-9/TGF细胞放射敏感性显著降低:随着照射剂量的增加,PC-9、PC-9/TGF以及PC-9/AB三组细胞的相对细胞存活数均逐渐减少。PC-9/TGF细胞在4Gy、6Gy、8Gy、10Gy剂量组相对细胞存活数与PC-9相比增加(P<0.05);PC-9/TGF细胞克隆成形率较PC-9增加(P<0.05);在4Gy剂量照射下,PC-9/TGF细胞较PC-9细胞凋亡减少,分别为(15.24±2.03)%VS(30.52±2.76)%(P<0.05);而PC-9/TGF和PC-9/AB两组细胞间相对细胞存活数、克隆成形率和凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);6、PC-9/AB转染CDH1基因后获得的PC-9/AB-CDH1细胞基因检测为EGFR基因19外显子突变,18、20、21外显子无突变,无T790m突变,无c-Met扩增。相对于PC-9/AB细胞,PC-9/AB-CDH1细胞逆转了EMT,表现为其细胞间连接变紧密,细胞恢复类圆形,即由间质细胞形态向上皮细胞形态转变;PC-9/AB-CDH1细胞的上皮型标记蛋白E-Cadherin表达增加,间叶型标记蛋白Vimentin表达减少,与EMT相关转录因子Snail表达减少;PC-9/AB-CDH1细胞较PC-9/AB细胞划痕愈合率下降,24h愈合率从(53.23±2.18)%下降至(37.16±4.15)%,48h愈合率从(83.88%±3.35)%下降至(49.32±3.12)%,其迁移能力减低;PC-9/AB-CDH1细胞对吉非替尼的敏感性明显高于PC-9/AB细胞,IC50值为分别为1.25μmol/L和9.68μmol/L(P<0.01);7、逆转EMT后PC-9/AB-CDH1细胞放射敏感性较PC-9/AB细胞显著增加:随着照射剂量的增加,两组细胞相对细胞存活数均逐渐减少。PC-9/AB-CDH1细胞在4Gy、6Gy、8Gy、10Gy剂量组细胞相对存活数较PC-9/AB细胞减少(P<0.05);PC-9/AB-CDH1细胞在2Gy、4Gy、6Gy、8Gy剂量组克隆成形率较PC-9/AB细胞减少(P<0.05);在4Gy剂量照射下,PC-9/AB-CDH1细胞较PC-9/AB细胞凋亡增多,凋亡率为(33.85±2.10)%VS(14.80±1.06)%(P<0.05)。结论本研究发现:伴有EMT的对吉非替尼获得耐药EGFR突变型NSCLC细胞PC-9/AB发生了放射抵抗,与其亲本细胞PC-9相比放射敏感性显著下降,PC-9经TGF-β诱导产生EMT后,其放射敏感性下降;而逆转PC-9/AB的EMT在恢复对吉非替尼敏感性的同时也增强了放射敏感性。提示EMT在NSCLC细胞EGFR-TKI继发性耐药后放射敏感性中有重要影响,EMT与NSCLC EGFR-TKI获得耐药后发生放射敏感性下降相关,可能作为EGFR-TKI获得耐药后放疗敏感性预测指标。