骨骼肌损伤是运动医学中常见的损伤之一，问题是骨骼肌损伤后再生能力有限，结构及功能恢复常常不完全，愈合缓慢，并伴有一定程度的纤维化，易发生再损伤。研究发现，胰岛素样生长因子(IGF)是肌肉．再生过程中的重要因子，可促进体外培养的成肌细胞增殖和分化，局部注射外源性IGF—l可以加速损伤骨骼肌愈合。 在我们前期研究生的实验中，已经成功构建了携hlGF-1基因的真核高表达质粒pcDNA3．1-hlGF．1，并在体外转染C2C12成肌细胞，经检测发现体外培养4周后仍可有hlGF．1的表达，且具有良好的生物活性。随后，我们将携hlGF-1基因的成肌细胞植入损伤小鼠骨骼肌局部，发现可促进损伤后骨骼肌愈合标志产物MHC—IIb的mRNA及蛋白表达，并一定程度地抑制骨骼肌钎维化标志产物vimentin的mRNA及蛋白表达，从而促进骨骼肌愈合、抑制纤维化。 而携hlGF-1基因的成肌细胞在移植入小鼠体内后能否存活，骨骼肌损伤局部微环境是否影响转基因细胞的存活，转基因细胞在体存活寿命是否足以满足促进骨骼肌损伤的进程，是本研究拟解决的关键问题。鉴于已有研究证明外源性IGF一1可以促进内源性IGF-1的表达，我们假设转基因细胞的产物表达，同样可以促进鼠tGF-1的表达，进而从一个侧面阐述转基因细胞促进骨骼肌损伤愈合的作用机制。 本实验第一部分研究携hlGF一1基因的成肌细胞移植小鼠骨骼肌局部后的存活及转归、转基因细胞移植后的hlGF一1基因表达情况。将BrdU标记于移植前细胞，植入小鼠体内后，采用免疫组织化学方法证实移植细胞至少可存活30天。分别从mRNA水平和蛋白水平用实时荧光定量PCR方法和免疫组织化学方法证实hIGF．1在C3H小鼠中可长期稳定表达。 本实验第二部分研究携htGF-1基因的成肌细胞移植小鼠骨骼肌局部后对于内源性IGF-l表达的影响，来探讨携hlGF-1基因的成肌细胞促进骨骼肌损伤修复的机理。分别从mRNA水平和蛋白水平用实时荧光定量PCR方法和免疫组织化学方法证实hlGF-1基因的成肌细胞移植小鼠骨骼肌局部后可促进内源性鼠IGF-1因子的表达，从而进一步促进损伤骨骼肌的愈合。 第一部分 携人IGF一1基因的成肌细胞在小鼠体内存活及产物表达情况研究 目的：研究携hlGF一1基因的成肌细胞移植小鼠体内后的存活及转归，以及移植后hlGF—l基因的表达 方法：雄性C3H小鼠共80只(20—30g，7一11w)随机分为A组(正常小鼠转基因细胞移植组)、B组(正常小鼠空白成肌细胞移植组)、C组(受伤小鼠转基因细胞移植组)、D组(受伤小鼠空白成肌细胞移植组)四组，A、B两组分别于右侧腓肠肌中段注射转基因成肌细胞或空白成肌细胞，C、D两组以重力打击造成小鼠右侧腓肠肌中段顿挫伤，伤后第3天分别于致伤局部注射转基因成肌细胞或空白成肌细胞。注射细胞后2、5、10、20、30于各组由随：几抽取4只小鼠处死，取右侧腓肠肌中段进行检测，行BrdU免疫组化染色，检测外源细胞在体内的存活情况；A、B、C、D四组另行hlGF—I免疫组化染色及卜IGF—ImRNA荧光定量实时PCR，检测外源转基因细胞在体内表达hlGF一1情况。实验结果使用SPSS10．0统计软件进行统计学分析，以P<0．05为有统计学意义。 ．结果：①各组小鼠均有BrdU免疫组化阳性染色；②A、C两组均有hlGF一1mRNA表达、hlGF—l免疫组化染色阳性，B、D两组未检则到hlGF-1mRNA表达、hlGF一1免疫组化染色阴性。 结论：携hlGF一1基因的成肌细胞移植入正常及钝挫伤的小鼠体内后，可存活一段时间，并能稳定地分泌hlGF一1因子。 第二部分 携人IGF一1基因的成肌细胞对损伤小鼠内源性mIGF一1表达的影响 目的：研究携人胰岛素样生长因子一1(humaninsulin一1ikegrowthfactor一1，hlGF一1)基因的成肌细胞移植损伤小鼠体内后，mlGF—lmRNA及mIGF—l因子的表达情况。 方法：雄性CsH小鼠(20—30g，7一11w)共72只，分为A组(转基因成肌细胞移植组)、B组(空白成肌细胞移植组)、C组(生理盐水对照组)3组，于右下肢腓肠肌内侧面中段实施钝性打击，打击伤后第3天分别于致伤部位注入l×106个转基因成肌细胞、等量的空白成肌细胞或lOOul生理盐水；打击伤后2、5、10、15、20、30天，于各组中随机抽取4只小鼠处死，取右侧腓肠肌中段进行检测，以实时荧光定量PCR和免疫组化染色检测小鼠mlGF一1的表达，4只小鼠做正常对照。统计学分析使用SPSS10．0统计软件，采取One—WayANOVA方法进行检验，P<0．05具有统计学意义。 结果：①各组小鼠体内均有mlGF一1mRNA的表达．m13F一1免疫组化染色阳性；⑦A组小鼠mIGF—lmRNA的表达和mlGF一1因子的分泌表达明显高于B、C组小鼠。 结论：携hlGF一1基因的成肌细胞移植入钝挫伤的小鼠体内后，可促进mlGF—lmRNA的表达和mlGF一1因子的分泌，进一步促进损伤骨骼肌的修复。