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近二十年来，非放射性同位素免疫分析（Non-radioisotopic immunoassay，NRIA）得到了迅猛的发展。时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）作为NRIA的一种重要方法，除了具有分析灵敏度高、测量范围宽、精密度好等优点外，在多元待测物免疫分析（Multi-analyte immunoassay，MAIA）方面更具有独特的优势。 与传统的免疫分析方法不同，MAIA指通过一次加样、一次分析，同时对样品中二种或二种以上待测物进行测定（定量、半定量或定性）的免疫分析方法。MAIA可采用多探针标记法、单一探针空间识别法、双探针空间识别法等多种方式。多探针标记法通过对不同探针信号进行识别实现MAIA；而空间识别法则通过检测不同区域的探针信号实现MAIA。免疫分析以准确、快速、经济、简便为目的，MAIA为实现这一目的提供了一条途径。 以稀土离子（Re）络合物的配基作为标记物的TRFIA克服了传统有机荧光分子和稀土离子标记物的固有缺点，已逐渐成为新一代极具吸引力的分析技术之一。国内外多个研究机构在这一领域的大量工作为发现新的具有更佳综合性能的配基标记物提供了前提。 本论文分为三个部分，分别为综述、双标记血清TSH/TT4 TRFIA方法的建立和β-二酮类荧光络合物配基的合成研究。 论文的综述部分简略地介绍了免疫分析的一般原理和几种不同类型免疫分析的方法学特点，重点讨论了与血清TSH/TT4 TRFIA紧密相关的以下内容：1)TRFIA的特点和实施方式；2)影响免疫分析灵敏度的因素；3)MAIA的原理和实践。 论文的第二部分旨在以Eu3+/Sm3+为标记物建立血清TSH/TT4 TRFIA。我们首先采用考察了建立血清TT4 TRFIA多种不同模式和改善血清TSH TR-IFMA灵敏度的多种途径，这些工作为建立血清TSH/TT4 TRFIA提供了经验和数据。在上述工作的基础上，我们通过‘共包被’方式制备了高活性的固相抗TSH和抗T4抗体，以Eu3+/Sm3+为标记物建立了快速、灵敏、可靠的血清TSH/TT4 TRFIA。 论文的第三部分旨在合成能应用于TRFIA的β二酮类标记物配基。我们成功合成了多种不同的配基标记物，分析了其结构与其Eu3+络合物荧光性能的关系，初步摸索了其在TRFIA中的应用方式，并简单地讨论了以配基为标记物的TRFIA的一般问题。 通过上述工作，我们得到了如下结论： 1)以抗原包被方式建立血清TT4 TRFIA要求有较大的固相抗原包被量。 2)以固相第二抗体（S-Ab）为分离试剂建立的血清TT4 TRFIA，要求固相S-Ab对抗T4抗体有足够的俘获容量（Capturing capacity），否则，TT4测量值将受到基质效应的干扰而出现明显偏差。论文推荐了一种新的制备高活性固相链亲合素（SA）的方法，以固相SA作为分离试剂建立的TT4 TRFIA有效地消除了样品基质的干扰现象。 摘 要 3)以马来酚亚胺－疏基法制备了链亲合素－多聚赖氨酸复合物侣AF（l＊ 以 DTTA－Eu“标记SAI 不能得到稳定的标记试剂；而以DTPAA（二亚乙基三 胺五醋酸配）为双功能螫合试剂能对SA巾（l）进行有效标记。采用SAI＊ly（l－，EU’“能明显提高＊SHThJ＊M人的荧光强度，但由于非特异背景荧光的明显升 高，使用 SAIOly（l＞Eu”未能改善 TSH TRIFMA的分析灵敏度。 4）分别以鹰吩甲酚三氟丙酮（TT和苯甲酚三氟丙酮田TA）k能量供体配制了二种 共荧光增强液④FES卜在相同的仪器测量参数下，CFES对Eu”的荧光增强作 用约为 Wllac FESqluorescence enhnement solutioll）的 6－25倍。CFES对配制 试剂的纯度要求极高，增强离子个“中的极微量的杂质（特别是Eu”和sd勺能引 起显著的背景荧光。我们将背景较高的CFES应用于TSH TRJFMA，未能改善 TSH TRIF讪的分析灵敏度。。 5）二种检测抗体联用并采用生物素－亲合素信号放大体系能明显地提高血清TSH TR－IFMA的特异荧光信号，并将非特异荧光控制在较低的范围，因而有效地提 高了 TSH TR－IFMA的灵敏度。在此基础上建立的血清 TSH TR－IFMA的分析灵 敏度达0刀03 mlU／l。对临床样品的分析结果表明，本工作建立的超灵敏血清 TSH TRIFMA对甲亢病人和甲功正常病人的区分明显优于IRMA（免疫放射分析，分 析灵敏度：0刀4 IYinJ八）。 6）采用 Eu勺’“为标记物建立了血清 TSW TrIA。以‘共包被’方式制备了 高活性的固相抗TSH和抗T4 McAb，这种‘共包被’方式对于建立其它MAIA 有一定参考意义。 7)我们将h个TTA单元峰吩甲酚三氟丙酮)整合到同一分子中，制备了h种新的 多合螫合剂－fHazine－TTA和BTOT。由于Tiazine－TTA的－NH进入络合物配 位内层而产生了明显的荧光淬灭效应：而STOlEu”络合物能发出很强的荧光， 其检测下限达 9．gX 10一‘molfl。 8)通过二乙酞基三联苯与三种全氟取代竣酸乙酯的 Claisen缩合制备了三种具有高