论文部分内容阅读
第一章 猪肝脱细胞基质制备工艺研究及其生物学性质探讨目的:优化猪肝脱细胞基质的脱细胞流程。方法:通过H&E染色、DAPI染色、天狼星红染色、DNA含量测定等检测方法对聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)和十二烷基磺酸钠(SDS)两组制备的脱细胞基质(ECM)进行鉴定;并以质谱法等检测手段测定ECM的成分,比较两组脱细胞流程的区别。结果:TritonX-100和SDS两组都能制备符合标准的ECM;TritonX-100组对胶原蛋白和生长因子的保留优于SDS组;而GAG流失则较多。结论:综合运用胰蛋白酶/EDTA+TritonX-100+氨水的脱细胞策略可以制备符合标准的ECM。第二章 脱细胞基质覆层壳聚糖纤维载体的制备和表征目的:制备脱细胞基质覆层壳聚糖纤维的新型肝细胞支架。方法:基于碳二亚胺(EDC)/N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)介导的交联反应将脱细胞基质覆层到壳聚糖纤维表面。通过傅里叶变换红外光谱检测(FTIR)、X射线光电子能谱检测(XPS)、表面接触角分析(CA)、扫描电镜(SEM)、液相色谱分析(HPLC)等检测方法进行表征,确认脱细胞基质牢固覆层于纤维表面。选取ECM浓度、EDC/Sulfo-NHS摩尔比和EDC浓度作为反应因素进行正交实验,探讨反应的最佳参数。结果:FTIR、XPS、CA、SEM、HPLC等检测方法均确认脱细胞基质的成功覆层。正交实验分析最佳反应参数是ECM浓度5mg/ml;EDC/Sulfo-NHS摩尔比1:1;EDC 浓度 5mg/ml。结论:EDC/Sulfo-NHS介导的交联反应可以制备脱细胞基质牢靠覆层的壳聚糖纤维载体。第三章 脱细胞基质覆层壳聚糖纤维载体的生物学评价目的:检测脱细胞基质覆层壳聚糖纤维载体(CTS-ECM)生物相容性和细胞活性,为日后的临床应用奠定基础。方法:1、提取CTS-ECM纤维的浸提液,分别进行细胞毒性、溶血反应、皮肤刺激反应、皮内刺激反应、急性和亚急性全身毒性反应实验,评价CTS-ECM纤维的生物相容性。2、C3A细胞分别种植在CTS-ECM、未处理的壳聚糖纤维(CTS)纤维载体和Cytodex3微球载体上,于第1、3、5、7天提取载体和细胞培养液,检测C3A细胞在三种载体上的粘附、增殖、细胞形态、细胞活性和细胞功能变化,评价CTS-ECM的细胞活性。结果:1、CTS-ECM材料无毒性和刺激性,生物相容性良好。2、CTS-ECM组C3A细胞粘附、增殖、细胞活性及细胞功能均优于CTS组;CTS-ECM组与微球组相比,从培养第5天起前者的细胞增殖和细胞功能更活跃。结论:脱细胞基质覆层壳聚糖纤维载体具有良好的生物相容性和细胞活性。