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非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）指的是除酒精及其他明确的损伤肝脏因素所致的,以肝细胞内过度脂肪沉积为主要特征的一种临床病理综合征。21世纪以来,随着科技的进步和人民生活水平提高,NAFLD的发病率逐年上升,现已成为当今全球范围内最常见的慢性肝脏疾病。流行病学显示NAFLD的全球患病率为25%左右,截至2018年,NAFLD在我国的发病率高达29.2%,已成为我国第一大慢性肝病。NAFLD的发病机制具有多样性和复杂性特点,胰岛素抵抗,脂代谢紊乱,氧化应激,炎症等因素都可能导致NAFLD的发生发展。除此之外,遗传、环境也会对其产生影响,然而人们对NAFLD发病机制的研究仍略知一二。目前针对NAFLD的治疗方法也较为局限,主要在控制饮食,增加运动等对患者生活方式方面进行干预指导,专属治疗NAFLD的一线药物仍未被发现。二甲双胍是治疗2型糖尿病的首选一线药物,已在临床使用近60年,大约70%的2型糖尿病患者伴有NAFLD,众多研究证实二甲双胍能有效降低患者血清低密度脂蛋白胆固醇,游离脂肪酸,甘油三酯等脂类物质水平,改善肝脏脂肪变性,但其降脂机制仍未明确。Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4,KLF4）是一种含锌指结构的多能转录因子,参与调控多种细胞生物学过程,有研究提示KLF4在胰岛素抵抗中起到重要作用。本研究旨在以KLF4为切入点,探讨二甲双胍的降脂作用机制,对NAFLD发病机制进行深入的研究,选择有效的药物进行针对性治疗,为临床上制订出有效的治疗方案提供理论基础。目的:探究KLF4在二甲双胍改善肝脏甘油三酯蓄积中的作用及其机制研究方法:1.将C57BL/6N雄性8周小鼠分为对照组、模型组和实验组。对照组小鼠常规饲料喂养,模型组和实验组小鼠均给予高脂饮食喂养,喂养16周,成功建立小鼠脂肪肝模型。实验组给予二甲双胍（300mg/kg.day）灌胃治疗4周,对照组和模型组均予等体积生理盐水灌胃处理,每周记录小鼠体重变化。最后采用眼球取血方式取出并分离小鼠血清,称取肝脏重量,检测血清及肝脏中甘油三酯变化,并对肝组织冰冻切片进行油红O染色,动物水平证明二甲双胍的降脂作用。2.采用0.5m M油酸处理肝细胞24小时建立脂肪肝细胞模型。并用1m M二甲双胍处理模型24小时,运用油红O染色及TG含量测定来证明细胞水平上二甲双胍降脂作用。3.将C57BL/6N雄性8周小鼠分为2组,高脂饮食喂养16周后,经尾静脉注射介导KLF4敲低的腺相关病毒（AAV-Sh KLF4）对照病毒（AAV-GFP）处理12天后,2组小鼠同时给予二甲双胍灌胃（300mg/kg.day）4周,采用油红O染色及TG含量检测KLF4对二甲双胍降脂作用的影响。4.采用过表达KLF4的腺病毒载体（Ad-GFP-KLF4）和敲低KLF4表达的si RNA转染脂肪肝细胞模型,通过测定细胞内甘油三酯的含量和油红O染色,分析KLF4的表达对肝细胞脂肪变性的调控作用。随后使用1m M二甲双胍处理,从细胞水平上证明KLF4介导二甲双胍降脂作用。5.采用western blot、实时荧光定量PCR等方式分别检测小鼠和细胞脂肪肝模型及二甲双胍干预后的KLF4、CPT-1a的表达。6.采用western blot、实时荧光定量PCR等方式检测miR378a-5p与KLF4及二甲双胍之间的相互作用。结果:1.二甲双胍可以显著减轻体内、体外脂肪肝模型中的TG蓄积肝脏进行大体形态学观察与油红O染色结果显示,二甲双胍处理组小鼠体重、肝脏指数以及肝脏TG含量降低,表明二甲双胍可显著减轻HFD诱导的小鼠肝细胞脂肪变性。细胞油红O染色及TG含量表明,二甲双胍可明显改善油酸诱导的肝细胞脂肪变性。2.KLF4是肝脏TG代谢的重要调控因子。在体内、体外脂肪肝模型中KLF4的表达均明显降低;过表达KLF4可改善肝细胞脂肪变性Western blot结果显示,与对照组相比,HFD组小鼠肝脏中KLF4的表达明显降低,而二甲双胍喂养4周后,KLF4的表达则明显增加。在油酸诱导的脂肪肝细胞模型中,KLF4的表达明显降低,二甲双胍处理则提高了KLF4的表达。3.二甲双胍可上调KLF4的表达,敲低KLF4的表达则衰减二甲双胍的降脂作用通过KLF4过表达的腺病毒载体（Ad-GFP-KLF4）和敲低KLF4表达的si RNA分别过表达和敲低KLF4的表达。油红O染色和TG含量检测可以发现,KLF4过表达可显著改善肝细胞脂肪变性,敲低KLF4的表达可衰减二甲双胍的降脂作用。通过对肝脏进行大体形态学观察与油红O染色结果显示,发现在体内水平敲低KLF4的表达也可衰减二甲双胍的降脂作用。4.二甲双胍通过下调miR-378a-5p,进而促进KLF4的表达,导致CPT1a表达增加,促进脂肪酸氧化分解qRT-PCR结果显示,在脂肪肝细胞模型中miR-378a-5p的表达升高,而二甲双胍可下调其表达。Western blot和qRT-PCR的结果显示,miR-378a-5p可负调控KLF4的表达。结论:1.KLF4是肝脏TG代谢的重要调控因子,KLF4过表达可显著改善肝细胞脂肪变性。2.二甲双胍通过抑制miR-378a-5p的表达,从而增强KLF4的表达,导致CPT-1a表达增加,促进脂肪酸氧化分解。