在神经元和其他神经细胞中，钙调蛋白激酶Ⅱ具有非常重要的生理作用，其活化是一系列生理学改变的基础，因此实时有效检测钙调蛋白激酶Ⅱ活性具有相当重要的意义。有实验表明在GFP融合蛋白的某个氨基酸残基磷酸化会导致GFP荧光改变。作为钙调蛋白激酶Ⅱ特异性底物，突触素Ⅰa能够被钙调蛋白激酶Ⅱ有效磷酸化。为了实时监测钙调蛋白激酶Ⅱ的活化情况，我们通过转染GFP-突触素Ⅰa融合蛋白基因至PC12细胞，建立一株能够稳定表达GFP-突触素Ⅰa融合蛋白的细胞系。1.56mmol/L至50mmol/L浓度的CaCl2在不同程度上增加此细胞株表达的GFP-突触素Ⅰa融合蛋白荧光强度，这种荧光增强现象可能归因于荧光共振能量转移作用。使用激光共聚焦显微镜实时监测分析也发现25mmol/LCaCl2能够明显增加单个细胞中荧光强度。另一方面10μmol/LKN-93(钙调蛋白激酶Ⅱ特异性抑制剂)预处理细胞，可以明显抑制甚至降低2mmol/LL-Glu处理细胞引起的荧光强度增加，但是PKA特异性激活剂2mmol/LDb-cAMP不能使细胞荧光强度增加，说明荧光强度增加主要是由于突触素Ⅰa位点2和3被钙调蛋白激酶Ⅱ磷酸化所致而不是由于位点1被钙调蛋白激酶Ⅰ磷酸化引起。Westernblot结果也证实，在钙调蛋白激酶Ⅱ和突触素Ⅰa蛋白表达总量不变情况下，钙调蛋白激酶Ⅱ以及突触素Ⅰa磷酸化水平在细胞经25mmol/LCaCl2处理后明显升高，同样，KN-93预处理能够抑制甚至降低钙调蛋白激酶Ⅱ以及突触素Ⅰa磷酸化水平。因此可通过表达GFP-突触素Ⅰa融合蛋白的细胞监测钙调蛋白激酶Ⅱ的活化情况，建立起的该细胞系也可以作为潜在的钙调蛋白激酶Ⅱ活化剂的高通量筛选模型。 一、BMSCs参与脑缺血后大脑功能的重建 外部各种因素影响干细胞选择性表达各种组织特异性基因，可以对细胞表型产生重塑，达到定向分化的效果。synapsin作为神经元特异表达的一种蛋白质，具有多方面的功能，基因敲除以及反义核苷酸拮抗试验表明synapsin在神经元突起的产生以及延长、轴突分化生长以及维持、成熟等方面起着重要的作用。本实验通过研究缺血脑组织抽提液对培养BMSCs三个亚型synapsin基因表达的影响，发现三个亚型synapsin基因的表达经缺血脑组织抽提液培养后均有一定程度变化，特别是synapsinⅡa基因的表达在经缺血48小时脑抽提液培养处理后有显著升高。进一步使用含三个亚型不同synapsin基因pL(SYNⅠa)SN、pL(SYNⅡa)SN、pLNC(SYNⅢa)逆转录病毒载体介导感染基因进入大鼠BMSCs，经预诱导24小时以及诱导8小时后，大鼠BMSCs能够分化形成神经元形态的细胞，免疫荧光检测结果表明部分分化细胞表达GFAP或者NF200；与对照组相比，三种亚型synapsin的表达均能显著提高NF200表达细胞数量，这种作用以SynapsinⅡa为最明显，SynapsinⅠa最弱。而表达GFAP的细胞数量没有明显改变；实验结果表明缺血后大脑环境的改变能够促进BMSCssynapsin表达，这种基因表达增高能够有效地对骨髓基质干细胞所分化的细胞表型进行重塑，使其定向分化为神经元样细胞，并且参与缺血后大脑功能的重建，在BMSCs促进缺血后大脑功能恢复方面起到一定的作用。 二、BMSCs分泌可溶性生长因子抑制大脑缺血阴影区细胞凋亡、维持细胞存活 TUNEL染色显示MCAo后在大鼠脑组织缺血阴影区发生大量的细胞凋亡，BMSCs治疗能够显著地降低凋亡细胞的数量。为了探讨BMSCs抑制凋亡的机理，缺糖缺氧培养的星形胶质细胞用于模拟体内的缺血环境。实验结果显示，缺糖缺氧培养能够诱导星形胶质细胞凋亡发生，BMSCs共培养显著降低凋亡细胞数量。Westernblot分析结果表明，缺糖缺氧处理后星形胶质细胞中NFκB活化显著上升，BMSCs共培养能够通过抑制IκB的磷酸化而降低NFκB的活化。同时，缺糖缺氧培养星形胶质细胞可以导致凋亡诱导基因Bax表达升高，而BMSCs共培养则降低这种表达升高现象。BMSCs共培养还升高星形胶质细胞中c-Myc和Bcl-xl凋亡抑制基因的表达。由于已有实验证实EGF具有抗凋亡，促增值以及维持细胞存活的作用，因此我们用缺血后脑组织抽提液培养BMSCs，实时定量RT-PCR结果显示，缺血48小时的脑组织抽提液能够显著地增加BMSCs中EGFmRNA水平，EGF表达水平升高可能是BMSCs抑制凋亡发生的主要因素。本实验结果表明BMSCs通过抑制缺血后大脑NFκB活化水平，改变一些凋亡诱导基因或抑制基因的表达，降低大脑缺血后的细胞凋亡损伤，从而达到改善神经功能，促进损伤修复的作用。 三、BMSCs通过增高缺血区星形胶质细胞BMPs表达而增加内源性干细胞或前体细胞分化为星形胶质细胞并参与缺血后大脑的重建 骨形成蛋白(bonemorphogeneticproteins，BMPs)影响细胞的增殖和分化过程。缺血后大脑中的星形胶质细胞对BMSCs反应强烈。我们采用一种部分模拟大脑缺血环境的体外模型，即在缺氧和缺糖的条件下培养星形胶质细胞，研究BMSCs处理后星形胶质细胞中BMPs表达的改变，后者可能对缺血后大鼠神经功能恢复方面具有一定的作用。定量实时RT-PCR分析表明缺血后星形胶质细胞中BMP2/4表达降低，BMSCs处理后，缺血星形胶质细胞中BMP2/4表达水平明显提高；Westernblotting结果也证实了在BMSCs共培养的缺血星形胶质细胞培养液中BMP2/4蛋白水平升高现象。作为一类神经干细胞或前体细胞的来源，体外培养大脑室下区(subventricularzone，SVZ)细胞在整个大鼠一生尤其是缺血后能够参与大脑的神经再生。在体外培养SVZ神经球，用以探讨BMSCs处理缺血后星形胶质细胞产生的BMP2/4水平变化是否影响大脑神经再生过程。采用缺血星形胶质细胞与BMSCs共培养的培养液能够显著增加星形胶质细胞标志物GFAP的表达，但是这种增加并不代偿性降低β-Ⅲ-tubulin阳性SVZ成神经细胞的数量，另外升高的BMP2/4水平引发了培养SVZ神经球细胞中BMP下游效应物Smad1/5/8磷酸化水平增高以及Hes1(一种Notch信号通路诱导蛋白)表达升高，BMP特异性抑制剂Noggin阻止Smad1/5/8磷酸化水平和Hes1表达水平增高，同时降低SVZ前体细胞分化而来的星性细胞百分比。这些结果都表明BMSCs能够增加缺血后星形胶质细胞中BMP2/4的表达水平，这种改变通过激活相关的信号通路增加SVZ的胶质细胞生成，后者能填补缺血区周围细胞的死亡或凋亡，改善缺血周边区的微环境，促进缺血后大脑重建并由此改善中风后神经功能的恢复。