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旋毛虫病是一种世界范围广泛分布的人兽共患病,严重危害公共卫生安全。旋毛虫的整个生活史可在单一宿主完成,不同虫体阶段接触不同宿主体内环境,经过复杂的体内迁移最终特异性寄生于横纹肌细胞,而不被宿主免疫系统清除,说明虫体与宿主之间存在着非常复杂的联系。这个过程中旋毛虫分泌蛋白发起到关键作用。本文利用目前公认可行度较高的预测软件搭建分泌蛋白预测流程,从蛋白组数据范围对旋毛虫分泌蛋白进行预测及功能分析,为旋毛虫分泌蛋白的研究提供参考;对其中的IFN-y诱导的溶酶体硫醇还原酶(GILT)进行了克隆表达、序列分析和酶活性研究;通过siRNA介导的RNAi技术研究GILT可能的功能;最后评价其免疫保护力,为免疫预防研究提供依据。1旋毛虫分泌蛋白的预测和功能分析利用主流预测软件搭建分泌蛋白预测流程,预测旋毛虫蛋白组范围内分泌蛋白,分析其序列特征,并注释分泌蛋白功能。预测得到414个经典途径分泌蛋白和245个非经典途径分泌蛋白,占蛋白组2.40%。统计发现旋毛虫分泌蛋白的信号肽中存在三个基序。旋毛虫分泌蛋白及其信号肽主要由疏水性氨基酸构成,分泌蛋白的信号肽剪切位点则主要由亲水性氛基酸构成,信号肽剪切位点-3和-1两个位点氨基酸保守性高,可能是相关酶识别关键点。功能注释分析中发现,其中与核酸酶活性和蛋白酶活性相关的蛋白比例较高。2旋毛虫GILT基因克隆、原核表达、酶活性分析和组织定位克隆了旋毛虫GILT(Tsp-GILT)基因ORF,由801个碱基构成,翻译266个氨基酸,其中5’端前25个氨基酸为信号肽。Tsp-GILT包含了 GILT序列特性。进化树分析发现Tsp-GILT与哺乳动物和鱼类GILT距离较远,但是与十二指肠钩口线虫(O.dentatum)、有齿结节线虫(A.duodenale)属于同一大分支。同源建模预测Tsp-GILT 3D结构并比对人和大鼠GILT的预测结构发现,尽管氦基酸序列上存在诸多差异,但3D结构相似,特别是活性位点和特征序列位点空间位置高度保守。构建pET32a-Tsp-GILT载体表达并纯化复性得到重组蛋白。体外试验发现重组蛋白在酸性条件下存在二硫键还原活性。免疫荧光实验显示,在虫体靠近外皮和消化道的细胞表达量较高。3 siRNA介导旋毛虫GILT基因表达抑制后功能研究检测了旋毛虫不同阶段虫体的GILT表达水平;并利用小鼠IFN-γ体外刺激虫体观察虫体的GILT表达量变化;最后通过siRNA介导抑制GILT表达,来观察虫体各个生命活动的变化。结果显示新生幼虫GILT表达量显著高于其他两个阶段;用1 000ng/ml的小鼠IFN-γ刺激新生幼虫发现16-20h后虫体GILT表达量达到峰值。RNAi试验中发现,GILT表达抑制对肌肉幼虫体外存活率、成虫发育数量和成虫繁殖能力没有显著影响,但新生幼虫在宿主体内形成肌肉幼虫数量显著减少。4旋毛虫GILT重组蛋白免疫保护性研究将rTsp-GILT免疫小鼠后,通过静脉注射感染新生幼虫,检测免疫前、免疫后、感染后第2d、第4d、第7d、第14d、第28d和第35d的小鼠血清中的各个细胞因子的变化趋势,并在感染35d后收集并统计形成肌肉幼虫数量。结果表明GILT能够刺激小鼠IL-2、IL-4、IFN-γ和IL-17水平上升,对TGF-β1、IL-10的水平没有显著影响。静脉注射感染新生幼虫的小鼠,2-4d的IL-2、IFNγ显著高于对照组;7-14d的IL-4高于对照组。各组之间IL-10的变化和差异不显著。IL-17在感染后14d出现了峰值。TGF-β1在前期上升缓慢,到7-14天迅速上升并达到峰值,14-35d开始下降,但总体水平依然高于正常值。rTsp-GILT组的TGF-β1低于两个对照组。rTsp-GILT组肌肉幼虫数量显著低于对照组。上试验结果说明rTsp-GILT重组蛋白能够很好刺激小鼠免疫应答,并显著降低肌肉幼虫数量,具备疫苗潜在价值。