牛疱疹病毒1型和5型同属于α疱疹病毒属,二者的氨基酸相似性高达82%以上,而且其宿主动物主要是牛。但引起的临床症状却截然不同：由牛疱疹病毒1型(BHV-1)引起的传染病俗称牛传染性鼻气管炎,是一种牛的急性、热性、接触性传染病,主要引起呼吸道和生殖道疾病等,侵染途径主要是通过鼻腔到达三叉神经节最后形成潜伏感染；而BHV-5是一种嗜神经性病毒,经鼻腔到达嗅球或直接到三叉神经节形成潜伏感染,病毒会通过顺式转运侵染中枢神经系统,从而引起癫痫等神经症状。由于这两种传染病最终都可以在三叉神经节形成潜伏性感染而导致终身带毒,还有该病毒还有很多基因的功能以及二者在致病机理和临床表现的联系与区别还没有研究清楚,因此给该病的防治带来诸多困难。通过基因组比较,发现UL0.5基因只在BHV-1中编码。因此,本文对BHV-1中UL0.5基因在BHV-5中的功能进行研究,初步探究二者在临床症状不同的原因、病毒与宿主互作的分子机制以及在神经系统的感染机理。我们首先从BHV-1基因组中克隆UL0.5基因,然后利用同源重组的方法整合到BHV-5的基因组中形成嵌合病毒,然后分别通过体外实验和体内试验来对比亲本病毒和重组病毒的差异。1、体外实验本文首先通过反转录试验证明了UL0.5基因可以转录为RNA,然后用磷酸钙共转染的方法构建了BHV-5 UL0.5嵌合病毒以及其回复突变株,并且分别用PCR测序和Southern blotting对重组病毒进行验证。在UL0.5基因成功嵌合到BHV-5的基因组后,我们分别设计空斑大小比较、一步法增殖曲线和电镜试验来验证其在增殖能力上的区别。通过试验我们发现在相同的条件下相对于BHV-5野毒和回复突变株,嵌合病毒在细胞上形成的空斑明显减小,但其病毒粒子的大小却没有明显区别。然后取不同的时间点来验证病毒的增殖趋势,发现嵌合病毒在早期的增殖能力也明显的低于亲本病毒。Real-timePCR试验表明UL0.5基因的插入影响了BICP0基因的正常表达,但其下游同源臂ORF2基因的表达没有受其影响。通过在体外进行的一系列试验,我们对UL0.5基因的功能有了初步的认识。UL0.5基因可以作用于BHV-5基因组中其他基因,从而抑制了病毒在细胞上的增殖能力,并且降低了病毒的滴度。2、体内实验将试验兔随机分成4组：空白对照组、BHV-5 wt组、BHV-5 UL0.5组和BHV-5UL0.5R组。用鼻腔攻毒的方法对新西兰白兔进行攻毒试验,将不同攻毒组分开饲养,连续注射3天地塞米松并连续观察14天,到攻毒后第5天,野毒组和回复突变组开始出现明显的神经症状,到第10天恢复正常；而嵌合病毒从急性感染期到潜伏感染,没有出现过典型的神经症状,只有一些轻度的反应。然后选取第3、6、9天的试验动物,麻醉后做磁共振成像试验(MRI)。MRI试验表明,当BHV-5亲本毒和回复突变株病毒进入神经中枢后,会引起脑膜发炎出血,并且导致脑脊液的大量分泌；而正常对照动物的脑脊液本身很少而且变化不大,但嵌合病毒可以观察到少量的脑脊液的分布。通过鼻眼拭子和脑组织的分毒试验,发现嵌合病毒的分毒量明显低于亲本毒和回复突变株。最后我们通过免疫组化试验,更进一步的证实了三种不同的病毒在脑组织分布的区别,感染亲本毒和回复突变组的神经元数目比嵌合病毒的多.也就是说,UL0.5基因抑制了BHV-5在中枢神经系统中的传播和神经毒性。总之,通过体内外试验研究表明,UL0.5基因插入BHV-5基因组后,嵌合病毒与野毒相比,增殖能力下降,并抑制了BHV-5的神经毒性。本研究对理解BHV-1和BHV-5神经致病性差异的分子机理提供了一定的证据。