1.背景与目的:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是动脉的一种非炎症性、退行性和增生性的病变,可引起动脉壁增厚、管腔狭窄。AS起病隐匿,发病率高,可最终造成心肌梗死、脑血栓、下肢坏死等严重后果,不仅严重危害了人民群众的生命健康,还导致医学资源持续消耗,庞大的医疗费用已成为国家、社会和家庭的沉重负担。研究AS发病机制及其防治措施不仅具有重要的学术价值,还能产生巨大的经济和社会效益,必将在未来的生命科学临域占有重要的地位。AS发病机制复杂,“损伤反应学说”涵盖了数种学说,受到多数学者的支持。该学说认为内皮细胞直接与血液相接触,极易受到包括血流冲刷的机械刺激,氧化应激、药物的化学作用及免疫复合物沉积等多种损伤因子的侵犯,造成血管内皮细胞损伤或剥脱、内膜通透性增加、单核巨噬细胞浸润、血小板黏附、平滑肌细胞增生,从而构成了AS病理生理基础。有效再内皮化可以维持血管内皮细胞单层的完整性,预防AS的发生。目前,如何有效促进血管损伤后再内皮化已成为AS研究领域中的重要课题之一。内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)由造血干细胞分化而来,是血管内皮细胞的前体细胞,表达干细胞及内皮细胞的相关抗原。EPCs可由骨髓、外周血、脾脏中分离获得,在血管损伤时,EPCs从骨髓动员到外周血,迁移、黏附到损伤区域,增殖、分化为成熟内皮细胞,促进损伤血管再内皮化,维持内皮细胞单层完整性,从而起到修复损伤血管,预防AS发生的作用。雌激素在多种心血管疾病的发生发展中发挥重要的作用,探讨雌激素对EPCs生物学功能及损伤血管再内皮化的影响具有重要的研究价值。2.方法2.1 EPCs培养,鉴定密度梯度离心法获取小鼠骨髓及脾脏单个核细胞,在添加50ng/ml VEGF及其它生长因子的DMEM培养液中常规培养,倒置显微镜下观察细胞生长、形态学变化;UEA-I结合和DiI-LDL摄取实验观察EPCs是否具有内皮细胞功能特性;CD31、eNOS免疫组化及Sca-1、VEGFR-2流式鉴定是否具有内皮细胞表型;透射电镜观察是否具有内皮细胞超微结构;2.2观察雌激素对EPCs部分生物学功能的影响EPCs经无酚红无血清培养同步化后,加入17β-雌二醇,使终浓度分别为0.01、0.1、1μmol/L,改良Boyden小室、四唑盐比色法、人工计数、流式细胞仪观察EPCs分化、增殖、迁移、黏附、凋亡及血管新生能力的变化。2.3探讨ERs/PI3K/Akt信号通路在雌激素介导EPCs生物学功能变化中的作用RT-PCR、免疫组化及westernblot明确EPCs是否表达ERs;给予雌激素受体拮抗剂ICI182780及PI3K信号通路阻断剂LY294002,观察二者在雌激素介导EPCs迁移及增殖中的作用;westernblot观察雌激素受体拮抗剂及PI3K信号通路阻断剂对雌激素介导Akt蛋白磷酸化的影响。2.4雌激素促进损伤血管内皮修复的在体研究2.4.1雌激素促进EPCs动员及损伤血管再内皮化建立卵巢切除的小鼠颈动脉损伤模型,流式细胞仪观察雌激素治疗对损伤前、损伤后1,3天EPCs动员的影响;静脉注射伊文氏兰,观察损伤后7天血管再内皮化的情况;2.4.2小鼠行脾脏切除术,14天后行颈动脉损伤并进行自体脾脏来源EPCs移植(1×106),观察示踪细胞是否归巢于损伤部位,是否具有内皮细胞表型,观察损伤血管修复情况。2.4.3细胞计数观察脾脏及骨髓来源MNCs及培养后EPCs数量的差异,流式细胞观察不同来源MNCs Sca-1表达的差异。3.结果3.1. EPCs培养鉴定3.1.1细胞培养1d,相差显微镜下可见单个核细胞呈圆形,胞体透亮,折光性好,散在分布于培养液中;4d可以观察到部分细胞增多增大,伸展呈椭圆形、短梭形细胞,有少量细胞突起;培养7d,长梭形细胞较前明显增多,并呈簇状生长,有一定方向性,形成细胞克隆,LDL摄取实验发现中心圆形细胞荧光较弱,周边梭形细胞荧光强;14d可看到细胞首尾相连,长宽比大于4,具有成索状或网状血管样趋势;培养21d,细胞相互融合呈铺路石状。3.1.2 EPCs超微结构培养细胞约15-20um,细胞膜上有较多伪足,胞质内有一些杆状细胞器,外有被膜包裹,内为平行管状结构(Weibel-palade小体),同时可见大量吞噬小泡、线粒体、内质网等细胞器。3.1.3培养EPCs免疫化学染色胞质呈红色荧光,提示大量CD31、eNOS阳性信号存在(89.9±6.16%,92.4±1.77%, n=4),阴性对照未见染色,DAPI复染提示阳性物质存在于细胞浆。培养7d细胞流式细胞分析发现Sca-1阳性率为38.8±9.09%( n=5),VEGFR-2 55.9±17.18%( n=6)。3.1.4用acLDL-DiI和FITC-UEA-I对细胞染色后,通过共聚焦显微镜鉴定,红色荧光细胞为acLDL-DiI摄取阳性,绿色荧光细胞为FITC-UEA-I结合阳性,黄色荧光细胞为UEA-I和LDL双阳性细胞,被认为是正在分化的EPCs,培养细胞双染阳性数为87.32±5.13%( n=5)。3.2雌激素对EPCs部分生物学功能的影响3.2.1雌二醇对培养EPCs迁移功能的影响雌二醇治疗组迁移的EPCs数量增加(0.01μmol/L E2 vs对照组,42.1±8.15 vs 19.7±6.16,P<0.01);(0.1μmol/L E2 vs对照组,41.5±4.56 vs 19.7±6.16,P<0.01); (1μmol/L E2 vs对照组,55.3±7.89 vs 19.7±6.16,P<0.01)(n=12)。3.2.2雌二醇对培养EPCs增殖能力的影响MTT分析提示雌激素可促进EPCs增殖(0.01μmol/L E2 vs对照组,0.41±0.04 vs 0.38±0.06,P<0.05);(0.1μmol/L E2 vs对照组,0.46±0.06 vs 0.38±0.06,P<0.01); (1μmol/L E2 vs对照组,0.52±0.05 vs 0.38±0.06,P<0.01) (n=30)。人工计算的细胞数为对照组5.74±0.16×105;0.01μmol/L E2 5.94±0.29×105;0.1μmol/L E2 6.14±0.32×105;1μmol/L E2 6.19±0.33×105,P<0.01,n=30。3.2.3雌二醇对培养EPCs黏附能力的影响雌激素可以浓度依赖性的增加贴壁EPCs数量(0.01μmol/L E2 vs对照组, 38.7±6.94 vs 35.7±4.12, P<0.05); (0.1μmol/L E2 vs对照组,42.2±5.05 vs 35.7±4.12, P<0.01);(1μmol/L E2 vs对照组,47.9±5.97 vs 35.7±4.12, P<0.01)(n=30)。3.2.4雌二醇对培养EPCs凋亡的影响流式细胞分析提示雌激素可抑制EPCs凋亡(0.01μmol/L E2 vs对照组0.27±0.03 vs 0.29±0.02,P>0.05);(0.1μmol/L E2 vs对照组, 0.24±0.01 vs 0.29±0.02,P<0.05);(1μmol/L E2 vs对照组,0.21±0.02 vs 0.29±0.02,P<0.01)(n=3)。3.2.5雌二醇对培养EPCs血管新生能力的影响(0.01μmol/L E2 vs对照组, 2.9±0.7 vs 2.1±0.59,P<0.01);(0.1μmol/L E2 vs对照组,4.0±0.66 vs 2.1±0.59,P<0.01);(1μmol/L E2 vs对照组,4.7±0.48 vs 2.1±0.59,P<0.01)(n=15)。3.2.6雌二醇对培养EPCs分化能力的影响0.1、1μmol/L E2各组培养获得的贴壁细胞数量分别为154.3±11.83,218±39.78,均明显高于对照组130.3±16.32 (P<0.05,P<0.01);0.01μmol/L E2组贴壁细胞数量为138.9±9.58,与对照组无明显区别(n=12)。3.3 ERs/PI3K/Akt信号通路在雌激素介导EPCs迁移及增殖中的作用3.3.1 RT-PCR扩增PCR产物,琼脂糖凝胶电泳发现202bp及245bp的荧光条带;1,2,3,4,7天的MNCs行westernblot,DAB显色发现棕色免疫复合物沉淀,大小分别为56KD及66KD,与ERα及ERβmRNA及蛋白的预期位置一致;免疫组化提示EPCs胞浆及胞核中均有阳性荧光信号。3.3.2 ICI182780 (10μmol/L)+E2(1μmol/L)、LY294002(10μmol/L)+E2(1μmol/L)、E2(1μmol/L)及对照组各组的迁移细胞数分别为21.8±9.04,21.1±8.49,55.3±7.8,19.7±6.76 (n=12)。增殖的细胞数为5.85±0.22×105,5.80±0.17×105,6.19±0.33×105,5.74±0.16×105(n=30),MTT提示光密度值为0.398±0.033,0.389±0.036,0.519±0.055,0.376±0.058(n=30)。3.3.3不同浓度(0.01、0.1、1μmol/L )及不同时间雌激素干预后Akt Ser407位点蛋白磷酸化较对照组增强,提示Akt信号通路活化。ICI182780 (10μmol/L)或LY294002 (10μmol/L)预处理后Akt Ser407位点磷酸化蛋白活化减弱,提示ERs及PI3K参与雌激素介导的EPCs Akt通路激活。3.4雌激素促进EPCs动员及损伤血管内皮修复的在体研究3.4.1颈动脉损伤前各组外周血EPCs数量分别为卵巢切除+雌激素组(0.064±0.016%)、卵巢切除组(0.028±0.01%)及未切除卵巢组(0.063±0.022%)(n=11)。颈动脉损伤后1,3天各组外周血EPCs数量分别为,卵巢切除+雌激素组(0.42±0.135%,n=6;1.47±0.38%,n=5)、卵巢切除组(0.13±0.024%,n=6;0.25±0.024%,n=6)、未切除卵巢组(0.43±0.16%,n=6;0.65±0.21%,n=4)、卵巢切除+雌激素+LY组(0.12±0.019%,n=6;0.25±0.062%,n=6)及卵巢切除+雌激素+ICI组(0.12±0.019%,n=6;0.24±0.067%,n=6);3.4.2、卵巢切除组再内皮化面积较未切除卵巢组及卵巢切除+雌激素组减少(28.33±13.49 %,n=5;69.53±14.14 %,n=4;83.11±7.94%,n=5;P<0.01);3.4.3骨髓和脾脏MNCs Sca-1(n=4)阳性细胞率分别为58.9±2.72%;74.9±9.41%(P<0.05),单个核细胞的得率为(1.48±0.29×107 MNCs /2股骨及胫骨;4.32±0.83×107 MNCs/脾脏,n=6);体外培养14天可分别获得的EPCs数量为0.71±0.26×106 /2股骨及胫骨;1.29±0.32×10~6 /脾,n=6).3.4.4自体脾脏EPCs DAPI标记后移植,损伤血管部位可见蓝色荧光细胞,CD31染色阳性,提示EPCs可归巢于损伤血管部位,分化为内皮细胞,直接参与损伤血管内皮的修复。较正常组而言,脾脏EPCs移植后损伤血管再内皮化面积增加(65.8±3.9% vs 40.3±1.9%,n=6,P<0.05),内膜增生减轻(0.34±0.045 vs 0.74±0.181,n=6,P<0.05)。4.结论4.1小鼠骨髓及脾脏中含有EPCs,在一定的培养条件下,可向内皮样细胞分化;4.2雌激素可促进EPCs增殖、迁移、黏附和血管新生,抑制其凋亡;4.3小鼠EPCs表达ERα及β受体,位于胞核及胞浆;雌激素可能通过ERs/PI3K/Akt信号通路促进EPCs增殖和迁移;4.4雌激素可以通过ERs/PI3K/Akt信号通路增加外周血中EPCs数量;4.5 EPCs可归巢、定位于损伤血管局部,促进损伤血管再内皮化;4.6自体脾脏来源EPCs移植可修复损伤血管内皮、抑制新生内膜增生。