【摘 要】
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近年来,由于各类抗生素的滥用,导致越来越多的耐药菌在临床上出现,耐药菌引发的疾病给临床用药带来了很大的困难,致死率也不断上升,因此引起了世界各国的广泛关注。其中,β-内酰胺酶(β-lactamase)作为多数耐药菌的耐药“武器”,引起了广泛关注。VMB-1(vibrio metallo-β-lactamase 1)是最近在食源性溶藻弧菌中发现的一种新型β-内酰胺酶,根据其水解抗生素的种类和蛋白质结
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近年来,由于各类抗生素的滥用,导致越来越多的耐药菌在临床上出现,耐药菌引发的疾病给临床用药带来了很大的困难,致死率也不断上升,因此引起了世界各国的广泛关注。其中,β-内酰胺酶(β-lactamase)作为多数耐药菌的耐药“武器”,引起了广泛关注。VMB-1(vibrio metallo-β-lactamase 1)是最近在食源性溶藻弧菌中发现的一种新型β-内酰胺酶,根据其水解抗生素的种类和蛋白质结构特征,将这类酶划分为金属β-内酰胺酶(metallo-β-lactamases,MBLs)中的B1亚类,属于β-内酰胺类抗生素(β-lactam antibiotics)水解酶。VMB-1是由基因bla VMB-1编码,该基因位于一个含有整合子的高度可转移的IncC型质粒pVB1796中。研究发现,p VB1796可以通过接合实验高效地将bla VMB-1转移到其他革兰氏阴性细菌,从而传播耐药性。因此在不久的将来,携带该基因的菌株有可能成为超级耐药菌。本论文尝试利用蛋白质晶体学技术,针对VMB-1导致细菌产生耐药性的分子机制进行了研究,进行了以下工作:1)通过对bla VMB-1序列分析,采用基因重组技术构建出适合在原核体系表达,携带His-tag纯化标签的VMB-1蛋白表达质粒,成功可溶性表达并获得高纯度VMB-1蛋白;2)进行结晶初筛实验,在两个初筛条件中成功获得了规则单晶。并以这两个初筛条件为基础使用青霉素G(benzylpenicillin)、氨苄青霉素(ampicillin)和头孢氨苄(cephalexin)分别与VMB-1进行共结晶,经过优化,获得了尺寸较大,棱角分明的单晶,同时选取头孢呋辛(cefuroxime)和美罗培南(meropenem)作为底物分别对VMB-1进行浸泡处理;3)将上述复合物晶体带至上海同步辐射光源(Shanghai Synchrotron Radiation Facility,SSRF)和贵州大学室内光源进行X射线衍射,收集晶体数据,并使用处理软件对衍射数据进行处理,最终得到了较高分辨率的数据。由于VMB-1晶体存在底物结合的限制,目前只有VMB-1与美罗培南的复合物晶体结构得到解析。对VMB-1-meropenem晶体结构进行分析表明:i)VMB-1与大多数金属β-内酰胺酶的整体结构非常相似,都采用αβ/βα的折叠方式,其活性中心含有两个锌离子,因此表现出广谱活性;ii)对VMB-1的序列和结构进行保守性分析,发现其活性中心处保守的残基:His99、His101和His161与Zn1形成了配位键,Asp103、Cys180和His222与Zn2形成了配位键,这些保守残基对于两个锌离子发挥催化作用非常重要,同时Asn187和Lys183分别与底物形成了氢键,稳定了底物结构;iii)根据金属β-内酰胺酶催化抗生素水解的普遍机制,此次捕获到的VMB-1-meropenem晶体结构属于EP复合物;iv)发现了导致VMB-1晶体存在底物结合限制的原因在于该结构中一个不对称单位的两个分子在活性口袋开口处相互挤压,导致开口变窄,因此底物很难进入。本论文通过结构生物学手段,成功解析了VMB-1与美罗培南水解产物的复合物晶体结构。基于此复合物结构,发现了VMB-1结合碳青霉烯类抗生素的关键保守残基,并提出了VMB-1水解美罗培南的可能的分子机制。同时,讨论了导致VMB-1晶体存在底物结合限制的原因。复合物结构的解析及相关细节信息,将为后序深入研究VMB-1的水解机制奠定基础,也为相关的酶抑制剂的研发提供了重要依据。
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