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研究目的卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)表现为卵泡功能障碍,化疗引起的POF已经严重影响年轻女性肿瘤患者的生殖健康,研发新的防治手段刻不容缓。既有研究指出POF与卵巢颗粒细胞(Ovarian granulosa cells,OGCs)的损伤、凋亡密切相关。在脐带组织中含有大量具有强大增殖能力和多向分化潜能的干细胞,称为人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,huMSCs)。HuMSCs不仅具有间充质干细胞全部的生物学特性,同时其良好的增殖分化潜能和低免疫原性,使其成为组织工程理想的种子细胞和基因治疗理想的载体细胞。许多研究发现huMSCs对多种组织损伤具有修复功能,更可用于POF治疗,但其作用机制尚不完全明确。最新研究发现exosomes是一类真核细胞合成和分泌、直径在30-200 nm之间的膜性囊泡,其通过转移micro-RNAs以及蛋白质来介导细胞之间的通讯功能。HuMSCs合成并分泌大量exosomes,经靶细胞吞噬获取后,达到调控靶细胞基因和蛋白的目的。故本论文探讨huMSCs分泌的exosomes(huMSCs-EXO)是否为干细胞产生保护和修复作用的调控因子之一,采用分子生物学和细胞学技术体外验证huMSCs-EXO对损伤卵巢颗粒细胞的保护作用,并探索其分子调控机制。研究方法体外分离、培养、鉴定、扩增huMSCs,通过流式细胞术检测细胞表面抗原的表达。用胰蛋白酶消化法体外分离、培养、大鼠来源的原代OGCs,用免疫组化方法(抗FSHR抗体染色)鉴定,并建立化疗药物(顺铂)诱导的OGCs损伤模型。利用梯度超速离心法或试剂提取法富集huMSCs培养上清中的exosomes,用透射电镜观察其形态大小,用Western Blotting检测其表面标记物。利用荧光染色在显微镜下观察OGCs对exosomes的吸收和吞噬。将OGCs分为3组,对照组(A组)、顺铂损伤组(B组)、共培养组(C组,即用huMSCs-Exo和化疗药物顺铂同时处理OGCs),37℃、5%CO2、100%H2O条件下培养48 h,流式细胞仪(Annexin-IV和PI双染)检测细胞凋亡率,用Western Blotting检测DNA修复蛋白、细胞凋亡蛋白、抗凋亡蛋白(Bcl-2,Bax,Caspase-3,Cleaved Caspase-3,Cleaved PARP等)的表达情况,以验证huMSCs来源的exosomes对损伤上述细胞损伤模型的保护作用。研究结果体外分离培养huMSCs并稳定传代6到8代,细胞形态为梭形或多边形,呈漩涡状生长,均具有成纤维细胞样形态;huMSCs表达基质受体(CD44,CD105)和整合素(Integrin)标记(CD29),但不表达造血系细胞标记(CD34,CD45)。体外培养大鼠原代OGCs,对FSHR免疫组化染色后发现培养的OGCs纯度达到70-80%。用试剂提取法或梯度超速离心法分离富集出huc-MSCs培养上清中exosomes,透射电镜下观察到exosomes直径为30-200 nm,呈双层膜囊泡状结构；Western Blotting检测其表面标记物表达CD63, CD9, Hsp70, CD81,但不表达内质网标记Calnexin和溶酶体标记Lamp 1。荧光显微镜下观察到OGCs能够吸附和结合huMSCs-Exo。流式检测对照组(A组)活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞比例为85.50±4.45%、5.86±0.50%、8.69±2.15%；损伤组(B组)分别为71.37±3.10%、8.58±2.04%、17.26±2.67%；HucMSCs-EXO共培养组(C组)分别为80.09±4.00%、5.72±2.15%、10.27±1.46%。A与B、B与C组活细胞比例均具有统计学差异(P<0.05)。Western Blotting检测显示B较A组凋亡蛋白Bax, Cleaved Caspase-3增多,抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少,DNA修复相关蛋白Cleaved PARP增多,均存在统计学差异(P<0.05)；而C较B组Bax,Cleaved Caspase-3, Cleaved PARP减少,Bcl-2表达增多,均存在统计学差异(P<0.05)。结论及意义HuMSCs分泌的exosomes对化疗诱导的OGCs损伤具有一定的保护作用,提示huMSCs-EXO对于预防与治疗化疗诱导的POF具有可行性,为huMSCs防治POF提供新靶点,同时也为深入研究干细胞功能提供经验和依据。本课题研究国内外尚无报道,研究成果富有一定的创新,另外干细胞具有良好的临床应用前景,深入研究干细胞发挥修复和抗损伤功能的作用机制也符合“转化医学”的研究宗旨。