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CpG-ODN(Oligodeoxynucleotide，ODN)是由未甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤组成的寡聚脱氧核糖核苷酸，是一种强有力的免疫增强剂和疫苗佐剂。抗菌肽(antimicrobialpeptides，AMPs)是由生物体基因编码的广泛存在的，能够抵抗外界病原菌侵害，具有多种免疫活性的小分子多肽类物质。已有研究表明，人工合成的CpG-ODN和AMPs联合使用免疫仔猪比分别单独使用能够诱导更强的先天性免疫反应，对疫苗的佐剂效应也更有效，且对机体的毒副作用小，因此，CpG-ODN和AMPs的联合制剂有望成为一种高效低毒，很有潜力的新型免疫佐剂。 由于目前用于实验研究的CpG-ODN和AMPs多用人工方法合成，成本太高，无法在临床兽医中推广应用。为了克服这一难题，本课题组前期已经构建了分别含有10个和49个拷贝CpG基序的重组质粒pVAX10、pVAX49，并通过动物实验确认这2种质粒对猪具有最佳免疫刺激活性。本研究在此基础上，用分子克隆的方法分别把扩增出的抗菌肽PR-39的全长肽序列、成熟肽序列、pBD-1的成熟肽序列连接到载体pVAX1和pVAX10、pVAX49的多克隆位点处CpG基序的前面，通过菌落PCR、酶切和测序鉴定，成功的构建了PR-39及pBD-1与CpG串联真核表达载体，分别命名为pVAX1-PR-39(成)、pVAX1-PR-39(全)、pVAX1-pBD-1(成)、pVAX10-PR-39(成)、pVAX10-PR-39(全)、pVAX10-pBD-1(成)、pVAX49-PR-39(成)、pVAX49-PR-39(全)、pVAX49-pBD-1(成)。 用不同的重组质粒去刺激体外培养的猪淋巴细胞，提取总RNA，用RT-PCR方法检测重组质粒在细胞中的表达；用荧光定量测定不同处理组淋巴细胞MCP-1的表达差异；并同时用MTT法测定重组质粒对淋巴细胞的刺激增殖转化能力。通过比较不同重组质粒在相同时间同一剂量下对猪体外淋巴细胞的刺激效果，筛选出对猪具有最佳免疫刺激活性的重组质粒pVAX49-PR-39(成)和pVAX49-pBD-1(成)。 选取体外与CpG协同刺激效果好的抗菌肽真核表达载体pVAX49-PR-39(成)、pVAX49-pBD-1(成)、pVAX10-PR-39(成)和pVAX10-pBD-1(成)作为疫苗佐剂与仔猪大肠杆菌灭活疫苗混合免疫仔猪，取猪的体液用间接ELISA法测定样品中疫苗特异IgA和IgG抗体滴度。实验结果显示，在质粒pVAX49-PR-39(成)、pVAX49-pBD-1(成)中，抗菌肽与CpG基序的协同效果相当，对疫苗的免疫增强作用最强。然后用0.5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的pVAX49-PR-39(成)和pVAX49-pBD-1(成)质粒与疫苗联合免疫仔猪，发现20μg/kg质粒的免疫增强效果最好。推测在实验浓度范围内，质粒刺激效果具有剂量效应。最后用质粒pVAX49-PR-39(成)、pVAX49-pBD-1(成)分别与疫苗混合免疫母猪，测定所产仔猪体液中疫苗特异抗体含量，进一步验证了两种质粒可作为高效的疫苗佐剂，有望提高疫苗对仔猪的保护力。 以上结果表明，抗菌肽和CpG协作可以增强含CpG基序质粒对猪的免疫刺激作用，提高了猪对疫苗抗原的系统和当地免疫反应能力，对维持初生仔猪机体健康，起到了一定的保护作用，其中质粒pVAX49-PR-39(成)和pVAX49-pBD-1(成)可以作为有效的猪用疫苗佐剂。目前关于CpG-ODN和抗菌肽协作对禽畜类动物的研究较少，本文的研究结果将为CpG和抗菌肽协作在禽畜疫病防治中的应用奠定基础。