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目的探讨槲皮素诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制,阐明mTORC1-TFEB-溶酶体通路在槲皮素抗癌效应中的作用。方法选择不同时间点,采用不同浓度的槲皮素对人肝细胞癌HepG2和Hep3B细胞、人乳腺癌MDA-MA-231细胞、人结肠癌p53野生型(HCT116-p53WT)和p53敲除型(HCT116-p53KO)细胞做体外处理,对槲皮素影响细胞死亡、自噬和TFEB-溶酶体功能的作用机制进行研究。1.在细胞死亡方面:首先利用MTT和流式细胞术初步定量槲皮素的细胞毒作用;其次采用克隆形成实验评估槲皮素对细胞增殖的影响;最后用Hoechst染色和蛋白印迹法进一步确认槲皮素诱导的细胞死亡类型。2.在自噬研究方面:首先联用自噬抑制剂在荧光显微镜下观察自噬潮的变化并结合蛋白印迹法确认槲皮素对自噬的影响以及相关通路的调控;再用siRNA干扰自噬关键基因的表达去探究自噬对槲皮素诱导的细胞凋亡的影响。3.在TFEB-溶酶体机制研究方面:首先蛋白印迹法测定TFEB细胞易位及其作用于溶酶体靶蛋白的表达;其次利用共聚焦显微镜和流式细胞术检测溶酶体活性;最后用TFEB的siRNA转染来研究溶酶体在槲皮素诱导的细胞死亡中的作用。结果 1.槲皮素对肿瘤细胞增殖有显著的抑制作用,且呈浓度和时间依赖性;槲皮素在低浓度时(12.5-25μM)诱导肿瘤细胞G2/M周期阻滞,而在高浓度时(50-100 μM)则主要表现为诱导细胞凋亡;同时镜下观察可见核染色质浓缩和碎裂等典型的凋亡特性;蛋白印迹法进一步检测到凋亡相关蛋白发生活化,而在加入泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK后,抑制了槲皮素诱导的细胞死亡并反转了 caspase3和PARP蛋白的改变;更为重要的是以上变化不受p53蛋白的影响。2.自噬研究发现槲皮素诱导GFP-LC3融合蛋白从胞浆转移至自噬体膜积聚,在联用自噬抑制剂CQ后,荧光斑点数目进一步增多、亮度进一步增强;蛋白印迹表明槲皮素通过抑制mTOR及其下游蛋白S6、S6K、4EBP1的磷酸化水平来诱导自噬;而自噬关键基因Atg7的存在与否对槲皮素诱导的细胞死亡差异无统计学意义,即抑制细胞自噬不会影响细胞死亡。3.TFEB-溶酶体的机制研究发现槲皮素促进TFEB的核转位即从胞浆转移至胞核,TFEB活性增强并上调了其作用于溶酶体的靶基因mRNA转录和靶蛋白表达水平;流式细胞术和激光共聚焦的实验结果共同表明在槲皮素作用下溶酶体处于激活状态(pH降低,水解酶活性增强);在转染TFEB siRNA的HepG2细胞中发现,敲低TFEB显著保护细胞免受槲皮素诱导的细胞凋亡。结论 1.槲皮素诱导不依赖于p53的肿瘤细胞凋亡;2.槲皮素通过抑制mTOR诱导细胞自噬,但是槲皮素诱导的细胞自噬并不影响其促细胞凋亡作用;3.槲皮素促进TFEB核转位和提高溶酶体活性,而且TFEB激活在槲皮素诱导的死亡中起关键作用。