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腭裂(cleft palate,CP)是人类常见的先天性发育畸形,给患者及其家属带来极大的痛苦。探询腭裂的发病机制一直是口腔学领域研究的重点,但因其影响因素复杂,涉及多个方面,因此腭裂发生的确切病因至今仍未明确。全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,atRA)是维生素A的代谢产物,在胚胎发育过程中,调节着细胞的增殖和分化。同时,atRA也是一种常见致畸物,过量的atRA会抑制腭突的融合。在生物体的许多系统中,包括胚胎的组织和细胞,atRA可以调控转化生长因子β(transforming growth factor-βs,TGF-βs)的表达,而且在细胞增殖和分化过程中,atRA和TGF-β信号途径之间的相互作用至关重要。TGF-β信号通路的关键传导分子为胞质蛋白Smads。Smads为与线虫Sma和果蝇Mad蛋白同源的蛋白家族,是目前唯一被发现的TGF-β受体作用的底物,其中Smad2和Smad3是受体调控蛋白,该分子在被TGF-β受体磷酸化后可将TGF-β信号向核内传递,调控目的基因的表达。Smad7是Smad信号途径的负调控因子,可以与TGF-β受体结合抑制Smad2和Smad3的磷酸化。目前,众多研究证实TGF-βs在腭突融合过程具有极其重要的作用。然而,在atRA抑制腭突融合过程中,是否通过对Smad信号途径的影响来干预TGF-βs的作用,国内外均未见报道。本研究通过器官培养和建立动物模型来观察atRA对小鼠腭发育的影响,探索在腭突融合过程中atRA对中嵴上皮(medial edge epithelial,MEE)细胞内Smad信号途径的影响,从而进一步的分析atRA诱发腭裂的发病机制。方法:1.试验分组取8周龄的昆明小鼠,雌雄比例为3:1合笼过夜,次日阴道栓阳性的记为妊娠0天(gestation 0 day,GD0),共获得GD0孕鼠48只。将这些孕鼠随机分为两组:第一组为器官培养组,共24只;第二组为动物模型组,共24只。2.器官培养atRA溶于二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)配成不同浓度,随BGJb培养基加入培养瓶。实验组分3组,atRA终浓度分别为1μM、5μM、10μM,以0.1%DMSO为对照组。在无菌条件下取器官培养组GD13胎鼠的双侧腭板,按照腭板前后方向将腭板成对的放在微孔滤膜上,并使两侧腭板的边缘相互接触。然后,将腭板和微孔滤膜一起放入盛有BGJb培养基的Grobstein器官培养皿中,置于37℃、5%CO2饱和湿度的恒温孵箱中培养。取培养24小时对照组和5μM实验组的腭板,用于Western blot检测MEE细胞内磷酸化Smad2(phospho-Smad2,P-Smad2)和磷酸化Smad3(phospho-Smad3,P-Smad3)以及Smad7表达水平的变化。腭板培养72h时,HE染色,观察各组腭板的组织学形态;并取对照组和5μM实验组的腭板,用于TUNEL技术和免疫组织化学研究,检测MEE细胞的凋亡情况和层粘连蛋白的表达水平。3.建立动物模型将动物模型组的孕鼠随机分为两组:第一组为对照组,共12只;第二组为实验组,共12只。在妊娠第10天下午1时,实验组管饲atRA剂量为100mg/kg,溶于0.2ml玉米油中。对照组管饲等体积玉米油。实验组和对照组的孕鼠分别于GD12、GD13、GD14、GD14.5、GD15和GD16六个时间点处死,剖腹取胚鼠,切取胚鼠头部,常规石蜡包埋,用于组织学观察。并选择GD14、GD14.5对照组和实验组良好的组织切片,用免疫组化染色检测P-Smad2在实验组和对照组腭突中表达的差异,进一步证实atRA对Smad信号途径影响,并由此推断出atRA的可能致畸原因。结果:1.atRA对腭突融合的影响器官培养组内HE染色结果显示:腭板培养72小时后,对照组的腭突完全融合;在atRA终浓度为1μM、5μM的实验组,两侧腭突接触,中缝上皮(midline epithelial seam,MES)持续存在;在atRA终浓度为10μM的实验组,腭突没有接触。动物模型组内HE染色结果显示:对照组腭突发育正常,双侧腭突完全融合。实验组的腭突上抬明显延迟,腭突发育瘦小,以至于两侧腭突不能在中线处接触融合。2.atRA中嵴上皮细胞凋亡和基底膜退化的影响器官培养组内TUNEL技术和免疫组织化学结果显示:腭板培养72小时后,在对照组内,腭突MEE细胞的迁移和凋亡以及MES内基底层的退化都具有明显的特征;在实验组内,5μM atRA可以抑制中嵴上皮细胞的凋亡和基底层细胞的退化,并且还能诱导腭突间充质细胞的调亡。3.atRA对MEE细胞内Smad信号途径的影响器官培养组内Western blot结果显示:腭板培养24小时后,对照组在腭突融合过程中,腭突MEE细胞内P-Smad2和P-Smad3的表达量很高,Smad7的表达却被抑制;相反,在atRA诱导的实验组,腭突MEE细胞内几乎检测不到P-Smad2和P-Smad3的表达,而Smad7的表达量很高。动物模型组内免疫组化结果显示:对照组胎鼠腭突在GD14,处于水平生长状态,P-Smad2在腭突外缘中嵴上皮细胞内着色明显;在GD14.5,腭突处于融合的过程中,MES还没有完全的的消失变得不连续,P-Smad2的表达也不连续,在MEE细胞迁移的口腔上皮和鼻上皮的三角区域P-Smad2的着色很明显。实验组胎鼠腭突在GD14和GD14.5,没有正常的上升、融合,腭突的上皮细胞中均检测不到P-Smad2的阳性表达。结论:1.在腭突融合过程中,atRA可抑制MES内MEE细胞的凋亡和基底膜的退化,从而导致腭裂的发生。2.在腭突水平生长阶段,atRA可抑制MEE细胞中Smad信号途径的转导,从而抑制MEE细胞的凋亡和基底膜的退化,导致腭裂的发生。