论文部分内容阅读
目的:涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma, SACC）是最常见的涎腺恶性肿瘤之一。其主要构成成份是肿瘤性肌上皮细胞（neoplastic myoepithelial cells, NMCs）和肿瘤性腺上皮细胞，NMCs具有合成和分泌蛋白多糖（proteoglycans, PGs）的功能。而PGs的合成为肿瘤的生长和侵袭提供了良好的生存环境和营养物质。PGs是一类大分子糖蛋白，广泛存在于哺乳动物的组织中。SACC中PGs的含量高于正常组织。 PGs的生物合成需要在木糖基转移酶（xylosyltransferase, XT）的催化下进行。目前已知的XT有两种，即XT-Ⅰ和XT-Ⅱ。XT-Ⅰ是PGs合成的效率-限制阶段，对PGs的合成起到至关重要的作用。XT-Ⅱ是XT-Ⅰ的一个亚型，二者氨基酸的相似度小于55%，研究表明XT-Ⅱ与XT-Ⅰ一样参与PGs的生物合成。RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术是目前应用较广的一种基因沉默技术。其核心是将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）导入细胞，可使mRNA发生特异性降解，从而使相应基因得到沉默。本实验采用RNAi技术，比较单独沉默SACC细胞XT-Ⅱ基因和同时沉默XT-Ⅰ与XT-Ⅱ，对PGs分泌阻抑的效率。观察基因沉默后SACC-83细胞的形态变化及凋亡。方法：1细胞转染、筛选及分组：将短发卡RNA（short hairpin RNA, shRNA）真核表达载体shRNA-WJ7、WJ8、WJ9筛选后，得到阻抑XT-Ⅱ的有效转染质粒WJ7。阻抑XT-Ⅰ的有效转染质粒shRNA-WJ4为本实验室以往研究筛选确定。将阻抑XT-Ⅱ的shRNA-WJ7转染SACC-83细胞，命名为SACC-83-WJ7（XT-Ⅱ沉默组）；将阻抑XT-Ⅰ的shRNA-WJ4和阻抑XT-Ⅱ的shRNA-WJ7共转染SACC-83细胞，命名为SACC-83-WJ4&WJ7（XT-Ⅰ&XT-Ⅱ沉默组）；将空载体shRNA-HK转染SACC-83细胞，命名为SACC-83-HK（空载体组）；将未转染shRNA真核载体的SACC-83细胞组命名为SACC-83（未转染组）。2XT-Ⅰ与XT-Ⅱ基因沉默效率的检测：采用Real-time PCR技术，从mRNA水平检测，基因沉默后SACC-83细胞中XT-Ⅰ，XT-Ⅱ基因的表达。3PGs含量的测定：应用Blyscan Assay Kit试剂盒检测基因沉默48h后，分别测定SACC-83-WJ7细胞，SACC-83-WJ4&WJ7细胞，SACC-83-HK细胞，SACC-83细胞中PGs合成分泌的改变，进行统计学分析，比较各组PGs阻抑的效率。4透射电镜观察：将转染48h后的各组细胞分别进行透射电镜观察。观察SACC-83-WJ7细胞，SACC-83-WJ4&WJ7细胞，SACC-83-HK细胞和SACC-83细胞的形态学变化。5采用流式细胞术检测细胞的凋亡：分别检测转染48h后，SACC-83-WJ7细胞，SACC-83-WJ4&WJ7细胞，SACC-83-HK细胞和SACC-83细胞的凋亡率。结果：1真核表达载体shRNA-WJ7、 shRNA-WJ8、 shRNA-WJ9转染SACC-83细胞的荧光表达率分别为31.71%，22.05%，33.11%；转染SACC-83-WJ4&WJ7组的荧光表达率为34.18%；SACC-83-HK组的荧光表达率为51.10%；未转染组SACC-83细胞无荧光表达。2基因转染48h后， Real-time PCR实时定量检测结果显示：shRNA-WJ7、shRNA-WJ8中XT-Ⅱ基因mRNA沉默效率为分别为39.11%，14.88%，shRNA-WJ9对XT-Ⅱ基因mRNA无沉默作用。测得转染组shRNA-WJ4&WJ7沉默XT-Ⅰ基因的效率为36.87%，沉默XT-Ⅱ的基因效率为10.23%。shRNA-HK对XT-Ⅱ基因mRNA无沉默作用。3基因转染后48h收集细胞的培养液，采用Blyscan Assay Kit试剂盒检测发现，每106个细胞PGs的分泌含量分别为SACC-83-WJ7组（129.63μg），SACC-83-WJ4&WJ7组（82.38μg），SACC-83-HK组（193.50μg），SACC-83组（202.25μg）。SACC-83-WJ7组、SACC-83-WJ4&WJ7、SACC-83-HK组与SACC-83组相比，PGs合成抑制率分别为35.91%，59.36%，4.33%。统计学结果显示：PGs分泌量SACC-83-WJ7组和SACC-83-WJ4&WJ7组与SACC-83组相比，P＜0.05；SACC-83-WJ7组和SACC-83-WJ4&WJ7组与SACC-83-HK组相比，P＜0.05；SACC-83-WJ7组与SACC-83-WJ4&WJ7组相比，P＜0.05；SACC-83组与SACC-83-HK组相比P＞0.05。4电镜观察显示SCCC-83-WJ7组， SACC-83-WJ4&WJ7组，SACC-83-HK组，SACC-83组细胞，各组细胞形态未见明显改变，未发现细胞凋亡现象。5流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示： SCCC-83-WJ7组（3.17±0.76），SACC-83-WJ4&WJ7组（2.40±0.13），SACC-83-HK组（2.49±0.09），SACC-83组（1.40±0.22），各组未见明显细胞凋亡峰出现。结论：1单独沉默XT-Ⅱ基因，能有效抑制SACC-83细胞蛋白多糖的合成分泌。2同时沉默XT-Ⅰ和XT-Ⅱ基因，对蛋白多糖的抑制效率，显著高于单独沉默XT-Ⅱ基因对蛋白多糖合成分泌的抑制。