与传统洗脱色谱相比置换色谱具有分辨率高、处理量大等优点，但其机理较复杂，这在一定程度上限制了其在生物分离领域的应用。已有学者从宏观角度研究了置换色谱中动力学对等速置换列的影响，但对其微观过程研究较少。目前在置换色谱的微观研究上仍存在挑战。本研究主要利用共聚焦激光扫描共焦显微镜(CLSM)这一有效的微观实验手段研究了双组份体系在Q Sepharose HP上的置换分离过程。为达到这一目的，以绿色荧光蛋白(eGFP)和红色荧光蛋白(RFP)两种内源荧光蛋白为模型蛋白，糖精钠为置换剂，研究了不同盐浓度和置换剂浓度下置换剂对单组份及双组份体系的置换分离。单组份的置换色谱实验表明在140mmol/L NaCl和120mmol/L NaCl条件下，均能实现糖精钠对两种蛋白质的置换，糖精钠对双组份的置换分离则只能在120mmol/L NaCl条件下进行，在140mmol/L NaCl条件下无法实现对双组份的置换分离，此时流出液中两种蛋白质的区带重叠较严重，表明置换剂的诱导盐梯度效应对等速置换列的形成有重要影响。CLSM实验从粒子尺度揭示出置换剂的加入会在介质内部产生诱导盐梯度效应。140mmol/L NaCl条件的下CLSM实验显示在置换的初始阶段，两种蛋白质荧光减弱速率相同，表明糖精钠对这两种蛋白质的置换能力相同。在置换后期，RFP荧光减弱速率下降，当使用低浓度置换剂时，这种现象更加明显。同单组份体系相比，双组份的置换过程存在延滞期，主要表现在对eGFP置换过程的延迟，表明蛋白质的共同吸附对等速置换列的形成有重要影响。