淋病(Gonorrhea)的病原体是奈瑟氏淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)，人类是其唯一宿主。淋球菌感染传统的治疗方法多为抗生素治疗。因治疗过程中，抗生素的滥用和不正规使用，现已发现淋球菌的耐药菌株不断增多。淋球菌的耐药性问题已成为一个重要的公共卫生难题，本课题对上海地区淋球菌临床分离株的耐药性进行研究，结合分子流行病学方法对菌株的耐药机制进行了探讨，了解淋球菌的耐药特点，阐明淋球菌的相关耐药机制，为淋病的预防和控制提供参考依据。 第一部分：淋病患者流行病学特征分析及淋球菌分离株的耐药性监测 一、探讨目前淋病流行特征及病人就医行为的特点。在上海地区选择3所性病专科医院或门诊，对门诊病例中确诊为淋病者进行流行病学问卷调查。结果显示，淋病门诊病例中以男性居多(87.5％)，年龄分布以20岁～、30岁～、40岁～三组为主(93.8％)，职业分布居前三位者为工人、民工、干部，占全部病例的65.1％，传播途径以非婚性接触为主要传播方式(76.3％)；对性行为及疾病情况分析发现坚持使用安全套者占18.7％，出现淋病症状后仍有性生活者占28.8％；对就医行为分析表明，出现淋病临床相关症状后3天内就诊者占32.5％，有17.5％的病例愿意选择私人诊所或者不正规治疗，同时发现20.1％的病人两周内曾有抗生素使用史。从调查结果可以看出，淋病在上海地区仍然主要是以非婚性接触为主要传播途径；调查对象的性行为及疾病求医行为需要引导和促进，在出现淋病相关症状后仍有无保护的性行为发生，以及一些病人曾有使用抗生素史，存在着传播淋病的潜在危险，也容易促进行耐药菌株的产生及流行。 二、为了解淋球菌临床分离株对抗生素的耐药性，我们采用琼脂平皿稀释法测定青霉素、头孢曲松、四环素、多西环素、氧氟沙星、洛美沙星、环丙沙星、阿奇霉素和壮观霉素对淋球菌的最低抑菌浓度(MIC)，用纸片酸度法对菌株作β-内酰胺酶测定。并根据检测的耐药性结果对菌株和抗生素进行了聚类分析。结果表明，所检测的80株菌株中，所有菌株均对头孢曲松和壮观霉素敏感；其中87.5％对青霉素耐药，88.7％对四环素耐药，产青霉素酶的淋球菌(PPNG)和高水平耐四环素的淋球菌(TRNG)分别占45％和18.8％；对阿奇霉素的耐药率为94.7％；对氧氟沙星、洛美沙星和环丙沙星的耐药率分别为97.5％，95.0％和95.0％。依据耐药性监测的结果分别进行Q聚类和R聚类，可进一步将菌株分成四类，将抗生素分成三类，为研究耐药性与基因分型的联系打下基础，由耐药性监测结果可以看出，淋球菌临床分离株的耐药性非常严重，对淋球菌的耐药性进行连续性监测是淋病预防控制中必不可少的步骤。 第二部分 淋球菌基因分型及淋球菌耐药性关系的研究 一、建立并优化随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对淋球菌进行基因分型的方法，探索运用RAPD进行传染源追踪的可行性。采用四种不同的预处理方法提取淋球菌基因组DNA，按照扩增结果进行优劣比较；运用RAPD对淋球菌标准菌株进行区分及对经性伴传播的淋病病例进行RAPD指纹图谱比较。结果表明运用十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法可以抽提较完整的基因组DNA，获得良好的RAPD指纹图谱；各菌株的RAPD指纹图谱间有明显DNA多态性；临床经性伴传播的病例中获得了相似的RAPD指纹。研究表明，如果选择最佳的DNA抽提技术、合适的随机引物，运用RAPD指纹图谱可以对淋球菌进行有效基因分型，并可作为分子流行病学对传染源的追踪的一种辅助手段。 二、了解上海地区淋病病原体奈瑟氏双球菌的不同基因分型及各基因型与耐药性之间的对应关系。我们在建立了RAPD基因分型的基础上，运用RAPD技术对80株淋球菌临床分离株进行了区分，从分子水平对淋球菌进行基因分型，并在此基础上结合淋球菌耐药性监测结果探讨不同的基因分型与耐药性之间的关系。结果显示80株淋球菌分离株有着较为相似的RAPD指纹图谱，但各菌株的指纹图谱之间有一定的多态性，依据指纹图谱的多态性可将菌株区分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种基因分型，对此三种基因分型与A、B、C、D四种不同的耐药类型进行对应分析，发现耐药类型与基因型别之间存在对应关系。通过本研究发现上海地区淋球菌流行株有着不同的耐药特点及基因型别，耐药性与不同的基因分型之间存在着一定相关性(x~2=27.59，P＜0.05)。 第三部分 淋球菌耐药性与质粒的关系研究 一、了解淋球菌临床分离株的质粒分布情况，初步探讨其与淋球菌耐药性的关系。我们在前面淋球菌耐药性监测的基础上，应用碱裂解法对淋球菌的质粒进行了抽提，获得淋球菌临床分离株的质粒谱。结果共检测出有42.5kb、39.5kb、7.4kb和4.2kb的四种不同分子量的质粒，7.4kb和4.2kb质粒检出率较高，分别为75.0％和96.3％。质粒谱型有10种，其中以42.5kb+39.5kb+7.4kb+4.2kb、39.5kb+7.4kb+4.2kb、7.4kb+4.2kb及4.2kb四种类型居多，占86.25％。所有检测出的PPNG菌株(包括PPNG／TRNG)均含有7.4kb质粒，而所有TRNG菌株(包括PPNG／TRNG)则均含有42.5kb质粒和39.5kb质粒；而非PPNG或TRNG中所携带的质粒谱型则相对复杂。从而初步认为，淋球菌临床分离株所携带的4.2kb的质粒，在大部分菌株中可以检出，其在淋球菌耐药机制中的具体意义尚不清楚，而7.4kb的质粒可能会介导淋球菌高水平的青霉素耐药性，42.5kb及39.5kb质粒可能与介导四环素高水平耐药有关。 二、探讨淋球菌的耐药质粒与淋球菌耐药性之间的关系。我们对淋球菌耐药株所携带的耐药质粒进行质粒消除实验，同时以此消除的质粒转化感受态的大肠杆菌，比较耐药质粒消除和转化前后菌株的耐药性变化。结果表明，在亚致死浓度的十二烷基磺酸钠(SDS)作用下，淋球菌的耐药质粒可以被部分消除(仍然携带42.5kb的质粒)或者完全消除，且消除子在消除前后对抗生素的耐药性会发生改变；而耐药质粒在不同的种属的菌株之间可进行传递，可以将淋球菌的耐药质粒传递给感受态的大肠杆菌，筛选出的转化子分别携带含有tetM基因的42.5kb的四环素耐药质粒和携带含有TEM-1基因的7.4kb的青霉素耐药质粒，转化子可产生对相应抗生素的耐药性。 第四部分 淋球菌耐药性与染色体耐药基因的关系研究 一、探讨淋球菌耐药株gyrA与parC基因突变与淋球菌对喹诺酮类抗生素耐药性之间的关系。结合前文琼脂稀释法测定淋球菌临床分离株对行喹诺酮类抗生素敏感性的结果，运用PCR技术扩增gyrA基因和parC基因的喹诺酮类耐药决定区(QRDRs)，并对典型菌株的PCR产物直接进行测序分析。产物测序结果显示淋球菌敏感株只检出gyrA基因Asp95单位点突变，中介菌株及耐药菌株在gyrA基因均检出有Ser-91→Phe突变并伴有Asp95或者Ala92位突变，同时有6株检出有parC基因的86、87、91位点突变及其它位置的无义突变。 进一步根据喹诺酮类耐药决定区测序的结果，我们针对不同的突变类型采用不同的扩增引物，为所扩增PCR产物在突变易发生的位置引入新的酶切位点，并运用HinfI、SalI、PstI等限制性内切酶对80株淋球菌临床分离株的相关PCR产物进行了多态性分析，综合测序结果及RFLP分析结果可证明gyrA基因和parC基因的喹诺酮类耐药决定区(QRDRs)的突变与淋球菌对喹诺酮类抗生素的耐药性密切相关，其中gyrA基因突变是淋球菌耐喹诺酮类抗生素的重要机制，而Ser-91→Phe更是引起对喹诺酮类耐药非常关键的突变，parC基因的突变可能会对淋球菌耐喹诺酮类抗生素起促进作用，常常伴随gyrA基因突变同时出现，与gyrA基因突变共同介导淋球菌对喹诺酮类抗生素的高水平耐药性。 二、探讨mtr系统在介导淋球菌对阿奇霉素耐药性中的作用，以及mtr基因系统之间的负向调节关系。对临床分离的淋球菌代表株mtrR基因序列及mtrR启动子区域回文结构序列的突变进行了测序分析，并运用荧光定量PCR技术对受mtrR基因调控的结构基因mtrC的表达水平进行了研究；同时结合前文对淋球菌耐药性监测的结果来揭示mtr系统和淋球菌对阿奇霉素耐药性的可能关系，结果表明所有中介菌株及耐药菌株均发生mtrR基因H105Y的突变，并伴随mtrR启动子区域回文结构的缺失突变；而敏感株有一株出现G45D的突变，但mtrR启动子区域回文结构均未检测出有突变。调控基因mtrR的突变影响了结构基因mtrC的表达，在有mtrR基因第105位密码子突变，并伴随mtrR启动子区域回文结构缺失突变的菌株与无此两位点突变菌株的mtrC基因表达有显著差异(x~2=9.525，P＜0.05)，并且在所检测的三组不同耐药性的淋球菌分离株之间mtrC基因的表达也有显著差别(x~2=15.94，P＜0.01)。说明了mtrR基因对其上游的结构基因mtrC、mtrD、mtrE有着负向调节作用，当mtrR基因及启动子发生突变时，会导致结构基因的过度表达，进而形成淋球菌对抗生素的耐药性。 三、研究淋球菌青霉素耐药性与penA及ponA基因突变的关系。分别运用PCR—SSCP、PCR—RFLP对淋球菌penA及ponA基因进行了分析，在所检测的80株淋球菌临床分离株中，所有菌株的penA基因均发生了(Asp-345A)的插入突变，改变了其表达产物青霉素结合蛋白2(PBP2)对青霉素的亲合力，而表现出对青霉素不同程度的耐药性。PonA作为编码青霉素结合蛋白1(PBP1)的基因，通过RFLP分析检测出有近93.7％的菌株发生了第421位氨基酸由亮氨酸变成脯氨酸(Leu421→Pro)的突变，此突变影响了青霉素结合蛋白1与青霉素的亲合力。同时研究还表明所有的PPNG菌株也可同时发生penA基因的突变，除两例ponA未突变外，绝大多数PPNG可发生ponA基因的突变。结果显示在淋球菌流行株中染色体介导和质粒介导两种方式协同作用造成了淋球菌对抗生素的高度耐药性。