在绝大多数的真核细胞中,均发现线粒体存在于其中,它是真核细胞的重要细胞器之一。线粒体是一种被称为‘半自主’的细胞器,因为其内含自己的遗传基因:一个长度一万六千碱基对左右的环状脱氧核糖核酸（DNA）,编码了多个蛋白及转运核糖核酸（tRNA）。线粒体负责细胞内的大部分能量供应,也就是三磷酸腺苷（ATP）的合成,被称为‘细胞内的电池’,同时还参与细胞内的多个过程包括:三羧酸循环、钙离子的储存、线粒体自噬、细胞凋亡、脂代谢、细胞增殖及代谢调控等。合成生物学是一门年轻的学科,旨在使用工程的方法合理的设计生命系统,而人工合成生命近年来是新起的研究方向,旨在从头合成生命甚至创造出自然界不存在的生物,近年来已经合成第一个人造生命——支原体以及多条酵母染色体。作为未来合成哺乳动物细胞的一部分,合成线粒体不可或缺,但是目前尚未有相关的研究。在此我们设计并合成了 C57BL/6J小鼠线粒体DNA（GeneBank:NC005089）并且在MT-CO1基因前端插入了绿色荧光蛋白（GFP）基因,作为标记基因。我们在大肠杆菌（E.coli）中使用克隆载体成功地大规模克隆出人工合成线粒体DNA。与此同时,我们使用化学试剂诱导NIH3T3细胞,得到了不含线粒体DNA的细胞系,我们把该细胞系命名为NIH3T3ρ0。随后我们在体外将合成的线粒体DNA通过电转的方法,将之转入到线粒体空壳中,装配成一个完整线粒体,得到人工合成线粒体,并在体外确定了了其具有转录活性。然后我们将人工合成的线粒体与小鼠巨噬细胞（RAW264.7）共培养,在两周时间内,通过观察,成功的发现了含有GFP荧光的细胞。接下来通过流式细胞术,我们成功分选出含有GFP信号的细胞系并命名为RCG。随后我们进行了一系列的鉴定。我们使用激光共聚焦荧光成像发现GFP信号完全和RCG细胞线粒体共定位。我们提取了 RCG细胞内线粒体DNA,通过设计的引物,使用PCR的方法和线粒体DNA直接测序的方法将合成的DNA序列扩增出并测序,结果也与我们设计序列吻合。荧光原位杂交实验也证明了 GFP基因与RCG线粒体共定位。通过提取RCG细胞RNA反转录成cDNA,利用qPCR实验在RNA水平上验证了 GFP基因的表达。提取出RCG的线粒体,然后使用该线粒体进行体外转录实验,确定其在体外的转录活性。Western blot实验发现GFP-MT-CO1共表达形式的蛋白,免疫共沉淀实验确定细胞内含有GFP蛋白并且和MT-CO1蛋白融合在一起。此一系列实验证实人工合成的线粒体在受体细胞内成功的激活。我们成功的得到一个含有人工合成线粒体细胞系,在世界范围内尚属首次,同时此细胞内含有一个线粒体基因表达的GFP,属于首次在哺乳动物线粒体基因组内敲入基因,填补了线粒体基因编辑方法的空白,为线粒体的基因研究也提供一种新的思路和方法。与此同时,在人工合成线粒体研究过程中,外源线粒体进入细胞后如何成功的被细胞内化并保持稳定性一直是困扰我们的一个问题,为此我们研究了细胞内线粒体稳态的相关因素。有研究报道线粒体作为一个细胞器在细胞比周围环境高约10℃,而线粒体膜间隙又同时具有氧化、pH等恶劣的胁迫条件。而分子伴侣蛋白如Hsp60和Hsp70,在线粒体膜间隙中被鉴定的很少。视神经萎缩基因1（OPA1）是调控线粒体内膜融合的关键基因,同时该基因具有多种功能包括能量代谢及细胞凋亡等方面。该基因的突变会导致多种疾病包括显性视神经萎缩、青光眼、Leber遗传性视神经病等。有研究报道在热激条件下,OPA1会被切割成短链可溶形式的OPA1（S-OPA1）,我们推测S-OPA1可能具有分子伴侣活性,对于线粒体的稳态可能具有一定的作用,为此我们进行了一系列的研究。我们首先在体外纯化了 S-OPA1蛋白（OPA1异构体5的200-978的氨基酸序列）,然后通过热变性和化学变性两种方式分析其分子伴侣功能,确定体外纯化的该蛋白具有一定的分子伴侣功能。随后通过在F.coli内表达可溶形式的OPA1发现可以提高E.coli对于热刺激的抗性。随后我们利用OPA1基因敲除的细胞及过表达S-OPA1的敲除细胞,确定其在热刺激下保护线粒体膜间隙蛋白,并结合质谱分析及免疫共沉淀技术,发现溶神经素（NLN）是其保护蛋白之一。通过该研究我们发现了 OPA1的作为分子伴侣的新功能,在体外和体内均可以提高蛋白对于热刺激的抗性,说明OPA1对于维持线粒体稳态可能具有重要的作用,对于外源线粒体进入细胞后维持稳定的问题具有一定的启发作用。综上所述,本文主要以人工合成线粒体研究为目标,在此过程中成功的内化了人工合成线粒体,使之可以永久的在细胞系中存活下去,且在此过程中,我们还发现了 OPA1的分子伴侣活性,对于维持线粒体稳态具有一定的意义,对于以后我们研究提高人工合成线粒体进入细胞后保持稳定的效率有一定的启发作用。