鸡传染性贫血病毒野毒株分离鉴定、全基因序列分析及致病性研究

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鸡传染性贫血(Chicken infectious anemia,CIA)是由鸡传染性贫血病毒(Chicken infection anemia virus,CIAV)引起的一种以再生障碍性贫血、全身淋巴组织萎缩、皮下和肌肉出血为特征的传染病。CIAV主要感染雏鸡,但所有日龄的鸡均易感。通过对广东省境内七个城市共14个养殖场进行CIAV血清学调查,了解广东省境内CIAV的流行情况,并对临床送检的CIAV疑似病料进行PCR鉴定、序列分析以及病毒分离鉴定。结果发现,采集的血清样本CIAV抗体阳性率为62.15%(202/325);PCR鉴定送检病料4份CIAV阳性;基因序列比对发现,4株CIAV分离株的开放阅读框均无核苷酸的插入或缺失,且VP1蛋白第394位氨基酸均为谷氨酰胺(Q),VP1、VP2、VP3蛋白基因与国内外参考毒株的核苷酸相似性分别为94.1%~99.6%、98.5%~100%、98.4%~100%;遗传演化分析显示,我国CIAV流行主要以C群为主,4株CIAV均属C2群,且与疫苗株遗传距离疏远,可确定均为野毒株;4株CIAV无法通过SPF鸡胚进行分离,但在MSB1细胞上进行连续传代5~6次,可在显微镜下观察到明显细胞病变,包括细胞肿胀、破碎、碎片增多等。利用CIAV阳性血清进行间接免疫荧光试验,可见明显的绿色荧光,证明此次分离的4株病毒均为CIAV。设计CIAV的特异性引物,建立实时荧光定量PCR检测方法应用于CIAV的临床检测。标准方程为Y=-3.55lg X+37.98,相关系数R2=0.997,扩增效率E=91.3%。该方法特异性高,对NDV、ARV、FAd V-4均无特异性扩增,对AIV出现了非特异性扩增曲线,但AIV的熔解曲线与CIAV的熔解曲线有明显差别,因此,该方法需要结合扩增曲线和熔解曲线进行阴阳性判定;灵敏度高,可检测到27copies/μL的阳性质粒,是普通PCR的10倍;重复性好,对3份不同批次的阳性质粒进行3个批内和批间重复,变异系数均小于2.4%。探究CIAV-GDJM株在MSB1细胞上的生长特性,结果发现,感染后0~24 h病毒增殖非常缓慢,几乎不增殖;感染后24~96 h,病毒开始以较快的速度增殖,感染后96 h病毒滴度达到最高。为探究广东省CIAV-GDJM株对SPF雏鸡的致病性,对1日龄SPF雏鸡腿肌注射0.2 m L/只的病毒液(100 TCID50),对照组腿肌注射0.2 m L/只的PBS。每组15只,分开正常饲养。在感染后7 d、14 d、18 d和21 d,4个时间点中,每组各剖检3只SPF雏鸡进行试验。结果发现,试验组SPF雏鸡表现喜卧、冠髯苍白、精神沉郁等临床症状。剖检可见,试验组SPF雏鸡的心、肝、脾、肺、肾、法氏囊以及肠道均未见明显的病理变化,但胸腺严重萎缩,骨髓黄染、脂肪沉积,未见死亡和肌肉出血。血沉试验显示,试验组SPF雏鸡红细胞压积值显著低于对照组(P<0.05)。病理切片显示,感染后14 d病理变化较严重;胸腺皮质区域严重退化;肝脏肝索排列紊乱、肝血窦增宽并有少量淋巴细胞浸润;脾脏淋巴细胞减少,红白髓界限不清晰,白髓面积减少;法氏囊的腔上囊小结稍萎缩,间隙稍增宽。抗体及细胞因子检测发现,CIAV特异性抗体的产生至少需要7 d;血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的浓度均有升高或降低,其中IL-2变化最为明显,其次是IL-4;IL-10和IFN-γ受影响不大。胸腺的病毒载量均大于其他器官,且感染后14 d肝脏、脾脏、法氏囊和骨髓的病毒载量均大于其他时间点,此外,感染后4个时间点大部分SPF雏鸡均检测到排毒(10/12),但病毒滴度较低(Ct>28)。本研究通过血清学调查、病毒的分离鉴定、全基因序列分析、快速检测方法的建立、病毒生长特性研究及致病性试验,阐述广东省境内CIAV的流行情况以及低剂量的CIAV也可导致SPF雏鸡出现相关的临床症状和病理变化,为广东省CIAV的防控以及疫苗的研制提供参考。
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