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背景:富营养化水体中的微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR,MC-LR)导致神经系统发育及功能严重毒害,然而目前尚无有效防护措施。课题组的前期研究发现MC-LR诱导PC-12细胞的骨架结构紊乱和骨架相关蛋白过度磷酸化,机制涉及细胞的氧化应激胁迫和蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)。丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)途径。黄连解毒汤(Huanglianjiedu Decoction,HLJD)源自唐代王焘《外台秘要》崔氏之方,全方由黄连、黄芩、黄柏、栀子四味药材组成,是清热解毒的经典方剂,主治三焦火毒证。近年来研究发现HLJD具有神经保护作用,并且其多种有效成分具有抗氧化作用,可能是MC-LR诱导的神经毒害潜在的保护剂。方法:我们采用PC-12细胞在不同剂量和时间点进行MC-LR染毒,并给予不同剂量HLJD处理,通过MTT法、PP2A酶活性检测、Western Blot等方法检测细胞活力以及细胞内相关分子(MAPKs家族)活化水平的变化。进一步我们采用C57BL/6J小鼠连续腹腔注射MC-LR,成功制备了神经损伤动物模型。在此模型上,分别给予3 mg/(kg·d)Donepezil(阳性对照组),2 g/(kg·d)、4 g/(kg·d)、8 g/(kg·d)HLJD进行预防处理。通过旷场实验、Morris水迷宫实验等行为学测试观察小鼠学习记忆能力和认知能力的变化,通过组织切片染色及免疫组化,评价小鼠脑组织中病理变化。结果:在PC-12细胞中,高剂量的MC-LR可抑制细胞活力,30μM和100μM MC-LR可造成的抑制率分别为21.6%和87.9%,JNK的抑制剂对MC-LR诱导的细胞活力下降有一定的保护作用。MC-LR可剂量依赖性地抑制PP2A的酶活性,3μM MC-LR从12 h开始对PP2A活性有显著性抑制,12 h及24 h抑制率分别为38.6%和32.9%;10?M MC-LR自6 h开始即明显抑制PP2A活性,6 h、12 h及24 h抑制率分别为59.2%,73.3%和97.8%。MAPKs家族的时效及量效实验显示,10μM剂量MC-LR可明显诱导JNK、ERK1/2及p38的磷酸化水平上升。其中JNK在1 h时磷酸化水平即显著升高,至24 h有所回落;ERK1/2的磷酸化水平在6 h左右达到峰值,12 h开始回落;p38磷酸化水平峰值出现在12 h左右,在24 h开始回落。在6 h时间点,HLJD可以呈剂量依赖性解除10μM MC-LR对PP2A酶活性的抑制,其中在5 mg/m L剂量下其活性与空白组相当,1.25 mg/m L、2.5mg/m L以及5 mg/m L HLJD均可明显改善JNK、ERK1/2及p38的异常磷酸化。不同剂量HLJD均可以逆转10μM MC-LR诱导的核因子E2相关因子2/抗氧化反应原件(Nuclear Factor Erythroid-2 Related Factor2/Antioxidant Response Element,Nrf2/ARE)内源性防御体系的激活。在C57小鼠整体水平,连续腹腔注射10μg/(kg·d)MC-LR可引起小鼠认知障碍和学习记忆能力下降、神经元细胞突触损伤以及微管相关蛋白Tau异常磷酸化,并且诱导大脑皮质JNK及ERK1/2的磷酸化水平升高。HLJD可改善MC-LR引起的认知和学习记忆能力下降,其中低剂量及中剂量表现优于高剂量组,与阳性药Donepezil组相当;Donepezil与HLJD均可减轻MC-LR诱导的小鼠大脑神经元骨架异常、改善海马神经元突触损伤、减轻大脑皮质JNK及ERK1/2的异常磷酸化。结论:在体内和体外水平上,HLJD对MC-LR诱导神经损伤均具有保护作用,其机制可能涉及缓解MC-LR对PP2A活性的抑制,改善MAPKs通路的异常激活,防止神经元细胞骨架的过度磷酸化。本项实验提供了防治MC-LR的神经毒害的新思路,证明了中药在神经保护方面的潜力。