伴随着燃料乙醇的广泛应用,利用纤维素原料进行乙醇的生产越来越受到人们的重视。而木糖是木质纤维素水解液中含量仅次于葡萄糖的单糖,但传统的乙醇发酵菌株酿酒酵母不能利用木糖,因此将木糖代谢途径引入酿酒酵母是实现纤维素乙醇高效转化的关键因素之一。课题组前期已分别将两条木糖代谢途径引入酿酒酵母,并通过内源基因的超表达和菌株的适应性进化,获得了木糖代谢能力较高的重组菌株。在酿酒酵母利用木质纤维素水解原料生产乙醇的过程中,副产物甘油和木糖醇的积累,大大降低了乙醇得率。在糖代谢过程中,由于菌株生物量的合成,导致NADH积累,需要通过生成甘油来对其进行再氧化,使得副产物甘油积累。而木糖的代谢可以通过外源木糖还原酶(xylose reductase,XR).木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase,XDH)或木糖异构酶(xylisoe isomerase, XI)途经的引入使酿酒酵母获得利用木糖的能力,其中XR-XDH途径由于辅因子偏好性的不同而造成副产物木糖醇的积累,XI途径尽管不会受到该辅因子不平衡问题的干扰,但发酵过程依然会存在甘油的积累,从而使乙醇得率受到很大影响。为减少乙醇生产中的副产物积累,本论文将来源于乳酸乳球菌MG1363的NADH水合氧化酶NOX引入酿酒酵母,研究改变辅因子氧化还原水平对酵母菌株葡萄糖木糖代谢的影响。NOX可以在氧气的作用下氧化NADH生成NAD+,我们以呼吸缺陷型菌株BSLS002(Ru-XI).BSLS006(XR-XDH)为出发菌株,利用不同的表达载体和启动子进行不同水平NADH氧化酶基因(noxE)的表达,来探究胞内辅因子氧化还原水平对酵母菌株葡萄糖木糖代谢的影响。实验结果表明noxE.的引入可有效减少副产物甘油及木糖醇的积累,但是过量的表达会严重影响菌株的生长以及糖的利用能力,同时会增加乙酸的生成。在XI重组菌株中,利用附加体质粒GPD2启动子表达noXE,能够在不影响菌株生长及糖利用的情况下使甘油产量降低84%,乙醇产量提升8%,同时使菌株的最大比生长速率增加12%。而在XR-XDH菌株中,利用着丝粒质粒TEF1启动子表达noxE,可在对菌株生长能力影响较小的情况下减少83%的甘油产量以及60%木糖醇积累,不过该改造并没有增加乙醇的产量。同时noxE基因转录水平、NADH氧化酶的酶活水平以及胞内NAD+/NADH水平的检测结果也证明了不同启动子和表达质粒调控的NADH氧化酶在重组菌株的表达,对胞内辅因子水平的改变不同。3一羟基丙酸(3-Hydroxypropionic Acid,3-HP)是一种三碳羧酸,被美国能源部列为12种最具潜力的平台化合物之一,是一种非常有价值的化工中间体,可用来生产丙烯酰胺、丙二酸、1,3一丙二醇和丙烯酸等有价值的化合物。另外,3-羟基丙酸还是多种多聚物合成的前体。目前的制备方法为化学法,主要依赖于石油等不可再生资源,面临能耗高,污染大,副产物多,分离困难等问题。而生物法生产3-HP由于其条件温和、操作简单等优势,越来越受到人们的青睐,因而成为当今的研究热点之一。利用生物法生产3-羟基丙酸根据底物的不同可分为以甘油为底物和以葡萄糖为底物两大类。酿酒酵母具有对抑制物耐受性强、发酵性能好、不受噬菌体侵扰等优点,此外,酿酒酵母对于3-HP的耐受性很高,这为高浓度的3-HP发酵提供了良好的平台。以葡萄糖为底物合成3-HP,可以通过乙酰辅酶A梭化为丙二酰单酰辅酶A,然后丙二酰单酰辅酶A还原酶催化丙二酰单酰辅酶A的途径实现。该途径不消耗ATP,是一条较理想的合成途径。本实验在酿酒酵母中表达来源于橙色绿曲挠菌的丙二酰单酰辅酶A还原酶基因MCR,构建了一条利用葡萄糖合成3-HP的途径。该酶在酵母中得到了活性表达,酶活为0.11U/mg蛋白,但可能由于前体供应不足及辅因子不平衡,并未检测到产物。该3-HP合成途径消耗NADPH,产生NADH,其直接前体为丙二酰辅酶A,而丙二酰辅酶A由细胞质乙酰辅酶A羧化合成。。为增加前体供应,我们首先通过启动子替换超表达内源乙酰辅酶A羧化酶基因ACC1,加强乙酰辅酶A到丙二酰单酰辅酶A的合成；同时引入柠檬酸裂解酶基因ACL,或在丙酮酸积累菌株BY5419-A0中引入丙酮酸甲酸裂解酶基因,以期增加乙酰辅酶A供应。另外我们还在丙酮酸甲酸裂解酶表达菌株中引入外源NADP依赖型甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase)基因FDH,以期能够缓解由于甲酸合成带来的胞内辅因子不平衡的压力,从而增加3-HP的产量。目前菌株已经构建完毕,后续实验还在进行当中。