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CUL4B作为骨架蛋白参与构成Cullin4B-RING E3连接酶复合物(Cullin 4B-ring ubiquitinligases,CRL4Bs),通过催化组蛋白H2AK119单泛素化或底物多泛素化而介导蛋白降解,参与调控细胞周期、信号传导、DNA损伤修复、染色质重塑和胚胎发育等生物学过程。另一方面,CUL4B在乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肝癌和膀胱癌等多种实体瘤中高表达,通过转录抑制多种抑癌基因和miRNAs而在肿瘤发生发展中发挥重要作用。但是CUL4B在调控结直肠癌肿瘤干细胞(Colorectal cancer stem cells,CCSCs)中的作用及其机制目前尚不清楚。结直肠癌是世界发病率和死亡率最高的癌症之一,其死亡率高的主要原因是肿瘤转移性和耐药性强,而肿瘤耐药、转移和复发等特性都与肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)相关。CSCs是存在于肿瘤组织中的一小部分具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体。CCSCs在调控结直肠癌发生发展、治疗抵抗和复发转移中发挥重要作用,但其调控机制仍不完全清楚。近年来发展起来的病人来源的肿瘤类器官(Patient-derived tumor organoids;PDOs)由于高度模拟了肿瘤的异质性,再现了原位肿瘤组织学、基因组学及蛋白组学等特征,是更加接近于体内真实情形的癌症研究模型。该模型可以用于癌症的各方面研究,例如药物筛选、药物毒性测试和个性化医疗等,具有广泛的应用前景。此外PDOs的形成与CSCs的存在密切相关,因此结直肠癌患者肿瘤组织分离和培养的肿瘤类器官是CCSCs研究的良好模型。本论文主要利用结直肠癌细胞、结直肠癌肿瘤类器官和结直肠癌组织样本等为模型探讨CUL4B在调控CCSCs中的作用及具体分子机制。第一部分CUL4B促进CCSCs的形成、自我更新和转移我们的前期研究证实CUL4B在多种实体瘤中高表达,促进肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭能力。但是,CUL4B是否通过调控CCSCs而促进结直肠癌恶性行为呢?本部分分析CUL4B在结直肠癌中的作用,取得了如下结果下:(1)CUL4B在结直肠癌肿瘤组织及肿瘤干细胞中高表达:首先利用组织芯片检测了 75例结直肠癌肿瘤患者肿瘤组织及配对癌旁组织中CUL4B的表达,结果显示CUL4B在肿瘤组织中的表达水平显著高于癌旁组织。(2)CUL4B的表达水平与患者的生存期及淋巴转移显著相关:我们利用生存期组织芯片检测了肿瘤患者肿瘤组织中CUL4B的表达,结果发现CUL4B的表达水平与肿瘤患者的生存期显著负相关,即CUL4B的表达越高患者的生存期越短,CUL4B的表达越低患者的生存期越长。我们进一步分析了 CUL4B表达水平与肿瘤大小、分期分级及转移等病理特征的相关性,发现患者的年龄、性别、肿瘤大小及分期分级与患者肿瘤组织中CUL4B的表达水平无明显相关,但是CUL4B的表达水平和患者的淋巴转移呈显著正相关。(3)CUL4B在结直肠癌肿瘤干细胞中高表达,促进其成球能力:我们利用Western blotting 和 RT-PCR 检测 CUL4B 在 HCT116CSCs、HT29CSCs 和对应的分化细胞的表达,发现CUL4B在结直肠癌肿瘤干细胞的表达明显高于分化的肿瘤细胞。通过免疫荧光分析显示CUL4B与肿瘤干细胞标记物ALDH1在HCT116CSCs和HT29CSCs中共表达比例显著高于异表达比例。同时,我们在HCT116、HT29和PDOs中干扰或者过表达CUL4B,发现干扰CUL4B可以降低CCSCs成球能力和PDOs的形成能力,过表达CUL4B可以增加PDOs形成能力。(4)CUL4B促进CCSCs的自我更新能力:我们在已经富集的HCT116CSCs和HT29CSCs中干扰或者过表达CUL4B,发现干扰CUL4B显著降低HCT116CSCs和HT29CSCs的自我更新能力,过表达CUL4B显著增加HCT116CSCs的自我更新能力。(5)CUL4B促进CCSCs的裸鼠成瘤能力:利用裸鼠(BALB/c nude mice)成瘤实验,发现干扰CUL4B显著降低HCT116CSCs和HT29CSCs裸鼠的皮下成瘤能力。(6)CUL4B促进肿瘤转移能力:我们将过表达CUL4B PDOs及其对照PDOs消化成单细胞,通过脾脏注射重度免疫缺陷型小鼠(NOD-Prkdcem26I12rgem26/Nju mice,NCG)观察肝转移和肺转移情况。结果显示过表达CUL4B可以显著增加PDOs的肝转移及肺转移。类似,利用干扰CUL4B及其对照HCT116和HT29,通过尾静脉注射裸鼠观察肺转移能力,结果显示干扰CUL4B可以显著降低HCT116和HT29的肺转移。(7)CUL4B增强PDOs的耐药能力:我们选取了舍曲林(Sertraline)和氟西汀(Fluoxetine)进行耐药实验。结果显示干扰CUL4B的#16 PDOs和#02 PDOs与其对照相比,可以显著增加对Sertraline和Fluoxetine的敏感性,而过表达CUL4B的#16 PDOs与其对照相比,可以显著增强对Sertraline和Fluoxetine的耐药性。第二部分CRL4B协同PRC2抑制miR34a转录进而促进其靶基因表达上部分分析显示CUL4B通过调控结直肠癌肿瘤干细胞而调控肿瘤恶性行为。为了探究CUL4B促进结直肠癌的分子机制,本部分利用转录组测序(RNA-seq)、miRNA测序(miRNA-seq)和染色质免疫共沉淀(ChIP)等对CUL4B调控CCSCs的机制进行探究。得出如下的结果:(1)RNA-seq筛选出CUL4B调控CCSC的候选基因:我们首先对3对干扰CUL4B及其对照PDOs进行测序,发现8个基因(CUL4B,NRCAM,EDAR,UPK3A,FAM3D,CYP2T3P,LCNN2 和 MYCN)在干扰CUL4B的PDOs 中都显著下调。对这8个基因和13个在其中2个PDOs中表达显著下调的基因进行验证,显示其中7个基因(ID1、UPK3A、CYP2T3P、FAM3D、NPTX2、AGR3和MYCN)在 CUL4B 敲低的 PDOs 和 HCT116CSCs 与 HT29CSCs 共同下调。(2)CUL4B正调控MYCN表达:对上面筛选出的MYCN基因在PDOs和CCSCs中进行验证,发现CUL4B正调控MYCN表达。(3)CUL4B通过抑制miR34a促进MYCN表达:我们对CUL4B高表达及其对照PDOs进行了 miRNA测序,对发现的差异表达的miRNAs与TargetScan预测的靶向MYCN的miRNAs叠加分析筛选出2个候选miRNAs(miR34a和let7e)。RT-PCR验证证实CUL4B负调控miR34a,但不调控let7e。报告基因分析和拯救实验显示CUL4B通过抑制miR34a而促进MYCN表达。(4)CRL4B协同PRC2复合物抑制miR34a的表达:分析显示CUL4B调控miR34a不依赖于p53和miR34a启动子区域CpG岛的甲基化状态。ChIP实验证实CUL4B、DDB1、EZH2结合到miR34a的启动子区域,干扰CUL4B表达导致CRL4B和PRC2复合物及其产物在miR34a启动子区域的富集减少,证实CRL4B协同PRC2复合物抑制miR34a的转录。拯救实验显示由于干扰CUL4B导致结直肠癌细胞的成球和转移能力的减少可以通过抑制miR34a得以拯救。以上结果说明CUL4B促进肿瘤细胞干性是通过调控miR34a转录实现的。(5)CUL4B参与调控miR34a靶基因网络:我们分析了miR34a的其他靶基因——CD44、NOTCH1及NUMB的表达,发现CUL4B正调控这些靶基因。荧光素酶实验进一步证实CUL4B通过抑制miR34a促进NOTCH1表达。(6)CUL4B与miR34a及其靶基因在肿瘤组织中的表达及其相关性分析:我们收集了 38例结直肠癌患者的癌组织及癌旁组织,结果发现miR34a在61%(23/38)的肿瘤样本中低表达,CUL4B在68%(26/38)的肿瘤样本中高表达,MYCN在71%(27/38)的肿瘤样本中高表达,CUL4B、MYCN和miR34a呈现表达负相关,CD44、MYCN和CUL4B呈现表达正相关。