雪花莲凝集素(Galanthus nivalis agglutinim, GNA)对咀嚼式害虫和刺口式吸汁性害虫具有毒杀性能而且对高等动物相对安全,作为Bt蛋白、胰蛋白酶抑制剂等杀虫毒蛋白的功能互补和增强成分,成为植物基因工程中应用最广泛的植物外源凝集素。目前,对转基因GNA蛋白的检测主要集中在基于DNA分子的遗传学检测。酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)技术能够对直接关乎转基因食品安全的蛋白质进行检测,而且ELISA技术具有快速、灵敏等优点,适用于现场监控和大量样本筛查。兔单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)制备技术是目前相对较先进的生物技术之一。兔单克隆抗体技术应用于转基因食品蛋白的检测国内外未曾有相关报道。兔单克隆抗体相较于鼠单克隆抗体,具有能识别更多的新型表位、更高的亲和性和更强的特异性等优点。本研究拟通过获得高质量杂交瘤细胞的基础上,运用抗体重组技术获得兔单克隆抗体,以使收集得到的兔单克隆抗体的免疫捕获能力进一步提高最终建立一种检测GNA蛋白的基于兔单克隆抗体双抗夹心ELISA检测体系。其主要实验内容和结果如下：(1)抗GNA兔多克隆抗体的制备及鉴定运用SDS-PAGE凝胶电泳对GNA免疫抗原蛋白的分子量和纯度进行检测。结果表明,GNA蛋白分子量约为14.3KDa,且纯度较高,可作为独立的抗原引起机体的免疫反应。用BCA蛋白检测试剂盒测得GNA蛋白的浓度为1.64mg/mL。采用免疫技术,将GNA蛋白与等量弗氏完全佐剂乳化后注射入两只兔子(B3365,B3366)体内。经五次免疫之后选择免疫效价较高的兔子(B3366),取全血,经Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化兔多抗血清,并对其纯度和效价分别进行凝胶电泳和间接ELISA检测。结果表明,所获得的抗GNA兔多克隆抗体纯度较高,几乎不含其它杂蛋白,效价在8000～32000之间。(2)抗GNA兔单克隆抗体的制备及鉴定免疫两只兔子(B3365,B3366),选取效价较高的B3366号兔子的脾脏进入细胞融合阶段。将兔子脾脏淋巴细胞与240E骨髓瘤细胞融合。运用间接ELISA法,经过初筛复筛,获得双阳性克隆子6个(zju-17-2、zju-17-3、zju-17-5、zju-17-6、zju-17-14、zju-17-17),取其中三个(zju-17-3、zju-17-5、zju-17-6)进入抗体质粒重组阶段,选取分泌单克隆抗体能力强且抗体亲和性高的配对(zju-17-5(2L/2H)),进入单克隆抗体的大转生产,最后将收集到的抗GNA兔单克隆抗体经Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化。经SDS-PAGE凝胶电泳分析,证实了该兔单克隆抗体的纯度高,运用IgG检测技术和间接ELISA检测技术,分别获得该目标抗体的初始浓度为2.28mg/mL,效价在32000～128000之间,亲和常数为0.387×109L/mol。(3)检测GNA夹心ELISA体系的建立和应用用生物素标记的兔多克隆抗体,其标记率为2.40、抗体浓度为7.67×10-6mol/L、生物素浓度为1.84×10-5mol/L。经过尝试,确立的双抗夹心ELISA法是用4μg/mL抗GNA兔单克隆抗体作为一抗包被酶标板,二抗是稀释20倍的生物素标记的兔多克隆抗体。酶标抗生物素稀释400倍后加入,经显色9min,终止后测OD450。其中,GNA蛋白、生物素标记兔多抗和酶标抗生物素的稀释均用3%的脱脂牛奶。用该双抗夹心ELISA法检测GNA蛋白,检测限(LOD)可达3.9～7.8ng/mL,其线性检测范围为0.975～62.5ng/mL。为了验证该双抗夹心ELISA检测体系的实用性,将该方法应用于转GNA基因稻米的检测。通过对稻米进行预处理,再用双抗夹心ELISA法对其进行检测,并设置阴性对照和空白对照,同时制作标准曲线。试验结果表明,转GNA基因样品的OD450(0.41)明显高于阴性对照的OD450(0.17)和空白对照的OD450(0.14),如果不考虑稻米蛋白提取过程中目标蛋白的丢失,样品中GNA蛋白的含量0.08μg/g左右(GNA蛋白质量/大米重量)。