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背景与目的在全世界最常见的恶性肿瘤中,食管癌的发病率位居第8,死亡率位居第6位。在过去的40年中,随着诊断、手术和放化疗水平的不断提高,食管癌的5年生存率缓慢升高,但是依然低于19%。食管癌有两种主要的病理类型:食管腺癌和食管鳞癌。中国是世界上食管癌的高发地区之一,其中食管鳞癌占95%,是国内发病率第3、死亡率第4位的恶性肿瘤。和腺癌相比较,食管鳞癌的预后更差,其根治性手术后的10年生存率长期徘徊在20%左右。目前已经证实,淋巴结转移是食管鳞癌最重要的预后因素之一,食管癌淋巴结转移的状态决定肿瘤的分期、治疗方式的选择和预后。但是目前食管鳞癌淋巴结转移的机制尚不清楚,临床上也缺乏有效的预测和治疗食管鳞癌淋巴结转移的方法。Sox-3是一种转录因子,归属于Sox蛋白家族B1亚组。在脊椎动物胚胎发育早期调控神经细胞的发育和分化,并在发育过程中表达逐步降。近年来的研究发现,Sox-3是一种原癌基因,可能和肿瘤的发生发展相关。我们在前期的研究中,发现食管鳞癌组织Sox-3的表达与区域淋巴结转移和预后密切相关,表现为Sox-3高表达患者的淋巴结转移率明显升高,并且预后不良。提示Sox-3的表达可能促进了食管鳞癌的淋巴转移,并影响患者的预后。已有的证据表明,食管鳞癌患者肿瘤相关淋巴管的密度与淋巴结转移和预后相关。而VEGF-C/D-VEGFR3是调控淋巴管生成、淋巴管扩张和通透性主要的信号通路。VEGF-C或VEGF-D的高表达与肿瘤侵犯的深度、肿瘤分期、肿瘤淋巴管的密度、淋巴管受侵和淋巴结转移相关。综上,我们推测Sox-3的表达可能促进食管鳞癌淋巴结的转移,并且和淋巴管生成以及VEGF-C/D-VEGFR3信号系统相关。为了阐明Sox-3在食管鳞癌淋巴转移中的作用及可能的机制,我们利用本实验室已经构建的不同Sox-3表达水平的人食管鳞癌细胞模型,通过体外和体内实验,选择Western blot、RT-PCR、ELISA、免疫组化研究等方法研究,探讨Sox-3在食管鳞癌的发生、发展和淋巴结转移中的作用及其可能的机制,为探索食管鳞癌淋巴结转移的诊断和靶向治疗提供新的方向。方法1.利用本实验室构建的不同Sox-3表达水平的食管鳞癌细胞模型,通过Western blot和q RT-PCR验证其Sox-3的差异表达后,通过细胞培养、MTT增殖实验、流式细胞术、划痕实验、Transwell侵袭实验和条件培养基淋巴管内皮细胞成管实验考察在体外Sox-3的表达,对于人食管鳞癌TE-10细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移,特别是诱导淋巴管内皮细胞成管能力的影响。研究Sox-3对于食管鳞癌发生发展和淋巴转移可能的调控作用。2.通过裸鼠右侧腋下注射不同Sox-3表达水平的TE-10细胞,构建裸鼠移植瘤模型。对移植瘤的发生、发展过程、成瘤的大小和同侧腋窝淋巴结的大小进行比较,组织切片HE染色,检查比较淋巴结转移情况;通过Western blot和免疫组化,检测不同Sox-3表达水平的TE-10细胞移植瘤样本中VEGF-C/D的表达,来进一步研究Sox-3对于食管鳞癌淋巴转移的影响。3.在体外细胞培养,通过Western blot和ELISA实验检测抑制Sox-3的表达,对于TE-10细胞VEGF-C/D表达和分泌的影响。在淋巴管内皮细胞成管实验中,加入VEGFR-3的抗体SAR131675阻断淋巴管内皮细胞VEGFR-3的功能,来研究VEGF-C/D通路在Sox-3促进食管鳞癌淋巴结转移过程中可能的作用机制。结果1.通过Western blot实验和q RT-PCR实验证实,TE-10细胞经Sox-3 si RNA慢病毒感染后构建的不同Sox-3表达的人食管鳞癌细胞模型是成功的,对照组TE-10细胞和空载组TE-10细胞Sox-3的表达类似,均显著高于干扰组TE-10细胞。MTT、流式细胞术、划痕实验、transwell实验和条件培养基淋巴管内皮细胞成管实验证实:Sox-3可显著促进人食管鳞癌细胞的增殖、侵袭、迁移和淋巴管内皮细胞成管的能力,而对细胞凋亡有抑制作用。2.成功构建裸鼠移植瘤模型,测量结果显示:和Sox-3低表达的干扰组相比,Sox-3高表达的空载组小鼠移植瘤的生长速度和成瘤大小类似,但是移植瘤同侧腋窝淋巴结的体积显著增大。病理学检查显示Sox-3高表达组小鼠淋巴结的转移率显著增高。Western blot和免疫组化检测显示,空载组移植瘤组织VEGF-C和VEGF-D的表达均显著强于干扰组。表明表明Sox-3对食管鳞癌TE-10细胞体内成瘤和生长的影响不大,但是可能促进食管鳞癌的淋巴结转移,并且和VEGF-C和VEGF-D的表达相关。3.Western blot和ELISA实验结果显示,抑制TE-10细胞Sox-3的表达,可使其VEGF-C和VEGF-D的表达和分泌显著下降;在淋巴管内皮细胞成管实验中,使用SAR131675阻断淋巴管内皮细胞VEGFR-3的功能后,各组TE-10细胞成管的数目均显著下降,并且组间无差异。表明Sox-3在食管鳞癌TE-10细胞可显著上调VEGF-C和VEGF-D的表达和分泌,Sox-3促进淋巴管的生成,是通过VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3通路实现的。结论1.在体外Sox-3可显著促进人食管鳞癌细胞的增殖、侵袭和迁移,抑制细胞凋亡,但是在体内Sox-3对于食管鳞癌细胞成瘤的速度和大小影响不大。2.在体外Sox-3可显著增强人食管鳞癌细胞诱导淋巴管内皮细胞成管的能力,在体内Sox-3可促进食管鳞癌细胞成瘤后的淋巴结转移。3.Sox-3在食管鳞癌细胞的表达,上调肿瘤VEGF-C和VEGF-D的表达和分泌,作用于淋巴管内皮细胞,通过VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3通路,促进淋巴管的生成,是Sox-3促进食管鳞癌的淋巴结转移可能的机制。