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多糖及糖缀合物广泛存在于自然界中,参与多种重要的生理和病理过程,研究糖类分子的结构对于分析其作用机制具有重要意义。因此糖类分子的合成是目前糖生物学研究的重中之重,而糖类分子的合成需要以糖核苷酸为糖基供体。合成糖核苷酸最简便的途径是补救合成途径,即单糖在单糖激酶催化下合成糖-1-磷酸,然后在相应的糖焦磷酸化酶的催化下进行糖核苷酸的合成。而单糖激酶和糖焦磷酸化酶的底物适应性有限,亟待发现更多具有广泛地底物适应性的酶。本论文主要分为两个部分:一是对嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835)来源的糖核苷酸合成相关酶的酶学性质进行研究,并利用一锅法合成了几种糖核苷酸;二是在合成ManNAc-1-P的基础上,对于UDP-ManNAc的简便合成途径进行探究。半乳糖激酶(Galactokinase,GalK)能够催化半乳糖及其他单糖的磷酸化,为糖核苷酸的合成提供底物。为发现具有广泛的底物适应性的半乳糖激酶,在第二章中,我们首先表达纯化了嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835)来源的半乳糖激酶(GalKAmu),并以43种单糖及其衍生物为底物研究该酶的底物适应性。研究发现该酶具有较为广泛的底物适应性,可以利用43种单糖衍生物中的20种为底物,对C-2、C-4、C-6位取代基变化的半乳糖衍生物具有较强的耐受性,且催化效率与衍生物取代基的空间位阻和极性相关。同时我们发现该酶对 Glc(52.5%)、GlcNAc(15.5%)、Glc-2-N3(<5%)、Xyl(<5%)等葡萄糖衍生物和 D-ManNAc(58%)、D-ManF(37.4%)、D-ManNAz(6.5%)等甘露糖衍生物也表现出催化活性,这是首次报道可以耐受D-ManNAc的半乳糖激酶。此外,我们还发现该酶具有高效合成L-Glc-1-P(80%)的能力。然后我们进一步对多种糖-1-磷酸进行了大量合成纯化及结构鉴定。半乳糖激酶的产物糖-1-磷酸可以在相应的核苷转移酶的催化下合成糖核苷酸。在第三章中,对嗜黏蛋白阿克曼氏菌来源的葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶(glucose-l-phosphate uridylyltransferase,GalUAmu)进行了表达和纯化,使用GalKAnu和GalUAmu,以第二章中GalKAmu可高效催化的单糖为底物,一锅双酶法合成糖核苷酸。研究结果表明,GalUAmu可以和GalKAmu利用10种单糖衍生物中的4种为底物合成糖核苷酸。GalUAmu可以接受半乳糖-1-磷酸C-4位-OH的去除。另外,与已研究过的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶相比,该酶在UDP-ManF的合成上具有一定优势。我们推测该酶因与真核来源的GalU序列相似性较高而进化程度较高,导致底物适应性相对较差。通过Blast我们发现嗜黏蛋白阿克曼氏菌中的葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶(glucose-1-phosphate thymidylyltransferase,RmlA)具有 GalU 的保守序列G-X-G-T-R,由此猜测 RmlA会行使部分GalU的功能。在第四章中我们进一步对RmlA的催化活性进行了鉴定,发现RmlA也具有催化UDP糖合成的功能,且催化活性与GalUAmu相似,为嗜黏蛋白阿克曼氏菌糖缀合物结构的稳定性提供了基础。以第二章半乳糖激酶可以催化合成ManNAc-1-P为基础,我们提出了 UDP-ManNAc的简化合成途径。UDP-ManNAc作为脑膜炎奈瑟氏球菌A血清群(NmA)的主要毒力因子荚膜多糖(CPSA)合成所需的糖基供体,可以用于脑膜炎奈瑟菌A血清群糖缀合物疫苗的研究。我们表达纯化了拟南芥来源的UDP糖焦磷酸化酶(AtUSP)、肺炎链球菌来源的葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶(SpGalU)和空肠弯曲杆菌来源的UDP糖焦磷酸化酶(GlmU)三种酶。以第二章中纯化的ManNAc-1-P为底物,检测以上三种酶及第三章中的葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶(GalUAmu)和第四章中纯化的葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶(RmlA)有无催化合成UDP-ManNAc的活性。研究结果表明,这五种酶均不能催化UDP-ManNAc的合成,我们将进一步通过焦磷酸化酶底物结合中心的突变实现UDP-ManNAc的简便合成。综上所述,本论文对嗜粘蛋白阿克曼氏菌来源的糖核苷酸合成相关三种酶GalKAmu、GalUAmu及RmlA的性质进行研究,并在此基础上对其在简化UDP-ManNAc合成步骤中的应用进行了探究。这为揭示嗜粘蛋白阿克曼氏菌LPS合成机制奠定了基础,对于更多糖核苷酸的合成及其在糖缀合物合成中的应用具有重要意义。