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黄瓜（Cucumis sativus L．）原产于热带和亚热带区域，是一种重要喜温类蔬菜，生长适宜温度为25-32℃，低温界限为10-12℃，10℃以下生长停止，5℃有受害的危险，经过低温锻炼的幼苗能忍受短时间1-2℃的低温。由于种属内没有抗寒的资源材料，显著提高黄瓜的抗寒性就不能通过有性杂交转育，只能利用基因工程手段导入其他物种的抗寒相关基因，从而来打破植物遗传群体中抗寒种质资源缺乏的限制，为黄瓜抗寒育种提供新的种质资源。 冷诱导启动子RD29A受干旱和低温诱导而产生表达活性；cor15a基因在拟南芥菜抗寒中起重要的作用，CBF3冷调控转录因子基因能促进大量冷诱导基因在在常温下的表达。本试验将冷诱导启动子RD29A分别控制下的拟南芥菜cbf3冷调控转录因子基因和cor15a抗寒基因构建植物表达载体，分别构建成携有RD29A-cor15a-Tnos表达盒的植物表达载体pVCT2016和携有RD29A-cor15a-Tnos和RD29A-CBF3-Tnos串联双表达盒的植物表达载体pRD29A-CBF3。通过农杆菌介导，导入黄瓜基因组，创制出耐寒黄瓜新材料。 1 植物表达载体的构建 1．1 表达载体pVCT2016的构建 克隆载体pSAU1001经限制性内切酶XbaⅠ酶切后经DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段补平粘末端，再用SacⅠ酶酶切，电泳，从1％的琼脂糖凝胶中回收纯化426bp小片段；表达载体pRD29A-GUS-T经SmaⅠ和SacⅠ双酶切后回收13550bp大片段；用T4连接酶连接两个片断，转化大肠杆菌，在kan抗性的LB平板上筛选出阳性克隆，进行colony PCR鉴定和酶切鉴定。提取质粒pVCT2016，用冻融法导入农杆菌菌株LBA4404（pAL4404）中。 1．2 表达载体pRD29A-CBF3的构建：西南农业大学硕士学位论文 为了构建表达载体pRD29A一BF3，我们又构建了两个中间载体pBs.RD29A一cBF3和pGEM一肋29A一CBF3.克隆载体pVCTZolZ经月认班11趁必oRI双酶切后切成2635bp和1949bp两片断，回收小片段汪几”dlll尼co孙双酶切pBS n Ks+，乙醇沉淀去除12bP小片断，回收2949bP大片段，T4连接酶连接，构建成pBs-RD29A一CBF3;pBs一劝29A一cBF3经刀“成月叮clal双酶切后，回收1974bp小片段，pGEM·7zf经刀“优月叮c如I双酶切后，回收2988bP大片段，T4连接酶连接，转化大肠杆菌，构建成PGEM.RD29A￡BF3.pGEM.RD29A-cBF3用五七。RI酶切成2983bP和1978bP两片断，电泳回收1978bP小片断，P vCT2016经五七口Iu酶切后成线状DNA片段，T4连接酶连接，转化大肠杆菌和农杆菌，构建成植物表达载体pRD29A一BF3.2植物表达载体对黄瓜子叶的遗传转化研究2.1黄瓜子叶的遗传转化再生体系的优化 在前人工作的基础之上‘I，’·“‘，’·‘·’·”，对黄瓜子叶的遗传转化的培养基进行了优化，获得了优化的培养基配方，提高了外植体的芽分化率，克服了培养过程中出现的玻璃化，褐化现象。以2天龄的黄瓜子叶为外植体，以MS（1960年）为基本培养基，通过加入不同浓度和不同组合的BA、ABA和ZT，筛选到了试管苗分化最适培养基（璐附加BA Zmg/L+ZT lmg/L+超A0.smg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂的固体培养基）、不定芽生长培养基（MS附加3%蔗糖和0.7%琼脂的固体培养基）和根分化生长最适培养基（l/ZMS附加3%蔗糖+0.，%琼脂的固体培养基）. 在最适培养基上研究了黄瓜子叶外植体对卡那霉素的敏感性、预培养天数、共培养时间及感菌时间等因素的影响，建立了黄瓜高频转基因再生体系，即取1天龄的黄瓜无菌子叶在不定芽分化最适培养基OCM（MS加BAZmg/L+ZTlmg/L+ABAO，sm以L+3%蔗糖+0.7%琼脂的固体培养基）上预培养12天，投入到活化的农杆菌LBA4404（pRD29A一CBF3+P AL44O4）菌液中浸染15分钟，在ocM上暗培养2天，在附加Carb 300mg/L的ocM培养基上延迟筛选培养一周后，转入筛选培养基（戊M+Kan80m岁L+c arb ZOOmg/L）中筛选抗性愈伤和抗性芽，每两周更换一次培养基，抗性芽转入不定芽生长培养基中培养12周，然后转入生根培养基中诱导生根，共获得具有Kan抗性的黄瓜再生芽14个，共获得9株抗性再生植株。2.2转基因黄瓜的分子鉴定 .取Kan抗性的黄瓜植株叶片，用CTAB法提取的基因组DNA作为PcR扩增的模板，以Tnos终止子的引物P’;和coR15A基因5’端引物P0:为成对引物进行PcR扩增。结果表明，有4株再生植株的基因组DNA能扩增出426bP的条带.同时，以P一RD29A启动子的5’引物P，与cBF3基因上的3’端引物P。，为成对引物进行PcR扩增，有两株再生植株的的基因组DNA能扩增出1638bP的条带，两对引物的扩增产物均与阳性质粒对照处于同一位置，同时，为了排除PcR中文摘要检测假阳性的可能，进行了转荃因植株的Southern杂交验证。杂交结果证明两株转基因植株中其中一株植株的目的基因拷贝数为2个，另一株为一个拷贝，证明目的基因已经导入黄瓜基因组中。