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目的:1)克隆丝氨酸蛋白(Serine Proteases,SP)基因并通过原核表达系统表达SP;2)确定SP在两种棘球绦虫不同发育阶段的表达情况;3)测定自然蛋白囊液蛋白和重组蛋白SP的水解酶活性及对细胞趋化的影响。方法:1)PCR扩增获得EgSP和EmSP片段并测序;根据原核系统密码偏好性进行密码子优化并合成EgSP功能结构域部分的基因(SP1)和EmSP全长基因(SP2),构建重组质粒pET30a-SP1和pET30a-SP2,NdeI/HindIII双酶切并测序,将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)菌株中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达蛋白的分子量和表达丰度;2)表达产物经亲和层析(Ni-IDA树脂)纯化,透析复性蛋白;3)重组SP免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并通过ELISA检测抗体效价,Western blotting检测重组抗原的免疫原性;4)通过qRT-PCR和Western blotting的方法确定SP在两种棘球绦虫不同发育阶段的表达情况;5)通过水解Z-Phe-Arg-AMC和Z-Arg-AMC检测蛋白的水解活性;6)通过细胞迁徙实验分析包虫SP对C5a趋化作用的影响。结果:1)通过生物信息学软件比较分析了EgSP和EmSP的基本特性,发现两者具有相同的分子质量、信号肽、跨膜区、空间结构及功能结构域,且38 KDa是含有胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白保守结构域;2)PCR扩增SP片段为1455 bp,测序鉴定正确后合成SP1和SP2基因,构建的重组质粒pET30a-SP1和pET30a-SP2酶切后电泳和测序表明阅读框架序列与设计一致。IPTG诱导表达蛋白主要以包涵体形式存在,表达蛋白的相对分子质量约为38×10~3和54×10~3,与预期值相符,且能被鼠抗His-Tag抗体识别。纯化蛋白可被囊型包虫病人和泡型包虫病人的血清识别;3)qRT-PCR结果显示丝氨酸蛋白酶在细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达为生发层和成虫的表达量高于原头蚴(P<0.001),但前两者之间无统计学差异。多房棘球绦虫包囊生发层细胞中的丝氨酸蛋白酶相比原头蚴表达减少(P<0.001)。Western blotting结果与qRT-PCR相符;4)pH能够影响蛋白水解Z-Phe-Arg-AMC和Z-Arg-AMC的活性,SP1在磷酸钠缓冲液中活性最高,其次为在Tris-HCl中,在乙酸钠溶液中几乎没有活性,不能水解Z-Phe-Arg-AMC/Z-Arg-AMC变为游离的AMC。SP2与SP1结果相似,在磷酸钠缓冲液中活性最高,其次为在Tris-HCl中,在乙酸钠溶液中活性最低。HCF在磷酸钠和Tris-HCl中的活性与SP1和SP2一致,但在乙酸钠中水解Z-Phe-Arg-AMC的能力明显高于Z-Arg-AMC;5)重组SP可以降低趋化因子C5a吸引细胞迁徙的能力。提取的天然蛋白也能够降低细胞的趋化,但作用不及SP作用明显。结论:本实验克隆的SP基因在原核中成功表达,且具有良好的反应原性和免疫原性,且在细粒棘球蚴成囊过程中高表达,在多房棘球蚴成泡过程中表达量降低。包虫SP具有丝氨酸蛋白酶水解活性,能够降低补体趋化作用,提示SP在两种棘球绦虫幼虫的差异表达以及SP在两种棘球绦虫中的活性可能是不同病理表型的关键调节蛋白。