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由于顺铂在耗竭细胞-SH的同时还可抑制抗氧化物酶活性,破坏了氧自由基代谢的平衡状态,引发氧化反应激,使肾小管细胞产生氧化性损伤.该研究还将氧化性损伤在顺铂肾毒性中的作用进行研究.第一部分;氧化性损伤在顺铂肾毒性中的作用.目的;采用体外培养的猪肾小管细胞系LLC-PK1,考察顺铂引起的细胞内氧自由基的改变,并应用抗氧化物消除自由基的产生,结合顺铂的细胞毒性,研究氧化性损伤在顺铂肾素性中的作用.结论:1、顺铂可以使细胞内氧自由基产生增高,提示顺铂可引起氧化性损伤,.但自由基增高发生在3小时之内,工未随顺铂作用时间的延长而持续增高.2、NAC、DFO和DMSO都有效地预防顺铂引起的氧自由基的增高,但只有NAC能够预防顺铂细胞毒性.3、NAC能与顺铁结合而灭活顺铂,从而具有理想的预防作用.DFO与DMSO虽然能清除自由基,却不能预防顺铂细胞毒性,提示氧化性损伤不是顺铂所致毒性的主要原因.第二部分顺铂对蛋白酶体抑制作用的研究.目的:研究顺铂对蛋白酶体的抑制作用及其与凋亡的关系.结论:1、顺铂对蛋白酶体有一定的抑制作用,但它不是蛋白酶体的特异的抑制剂,抑制作较强.2、p53的表达变化并不能完全用蛋白酶体抑制解释,顺铂可能同时影响了p53表达的其它环节,但顺铂作用细胞早期p53的表达增高可能与蛋白酶的体的抑制有关.3、顺铂对蛋白酶体的抑制作用可能参与了调亡的发生.第三部分ERCC1表达载体的构建及其在肾细胞中的表达.目的:构建ERCC1表达载体并在肾细胞中表达;初步观察顺铂对ERCC1过表达肾细胞的毒性变化.结论:1、成功构建PCDNA3.1ZEO(+)-ERCC1真核表达载体及GST-ERCC1融合蛋白原核表达载体PGEX-2T-ERCC1.2、获得了稳定表达ERCC1蛋白的293细胞,为进一步转染XPF基因打下基础.GST-ERCC1融合蛋白也在大肠杆菌成功表达.3、过表达ERCC1蛋白的细胞对顺铂毒性显示一定的预防作用,提示顺铂毒性可能与PT-DNA加合物形成有关.