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目的研究胃动蛋白2(Gastrokine 2,GKN2)对CD44(+)SGC7901胃癌干细胞(Gastric cancer stem cells,GCSCs)增殖、迁移、侵袭、周期和凋亡的影响,初步阐明GKN2对GCSCs的抑制作用,为临床设计有效治疗胃癌的策略提供理论依据。方法1、构建GKN2载体质粒,瞬时转染人胃癌MKN28细胞,荧光显微镜下观察转染效率,Western Blot验证GKN2转染是否成功;从GKN2转染的细胞培养上清液中收集分泌蛋白,超滤法进行纯化和浓缩;采用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度,考马斯亮蓝染色、Western Blot验证分泌蛋白为GKN2。2、采用免疫磁珠细胞分选(Magnetic cell sorting,MACS)技术从人胃癌SGC7901细胞中分选出CD44(+)GCSCs,免疫荧光检测分选效率。3、运用CCK-8、肿瘤克隆球形成、Transwell迁移、Transwell侵袭和流式细胞术分析GKN2对GCSCs增殖、迁移、侵袭、周期和凋亡的影响;CCK-8实验比较GKN2与5-Fu和VP-16对GCSCs的增殖抑制作用。结果1、转染实验结果显示,GKN2载体质粒转染效率约为91%。westernblot实验结果显示,与未转染组(0.014±0.003)和空载体组(0.015±0.004)相比,mkn28细胞中gkn2转染组(1.037±0.030)gkn2蛋白的相对表达量明显增加(p<0.05),提示gkn2转染成功。2、收集分泌蛋白经纯化浓缩后测定蛋白浓度,结果显示,转染gkn2组的蛋白总浓度约为27.4g/l,未转染gkn2组的蛋白总浓度约为22.4g/l。考马斯亮蓝染色结果显示,与未转染组相比较,ad-gfp-gkn2转染mkn28细胞后主要分泌一种蛋白至培养液,根据条带的位置可以初步判断该蛋白为gkn2分泌蛋白,然后westernblot实验验证了该蛋白即为gkn2蛋白。3、免疫荧光结果:细胞胞膜呈现绿色荧光,未分选的sgc7901细胞cd44阳性率仅有9%,分选后的cd44(+)sgc7901细胞cd44阳性表达率为97%,证明从sgc7901细胞中成功分选gcscs。4、cck-8实验结果显示,10、20、40、80、160、320mg/l的gkn2蛋白作用gcscs24h、48h和72h后均能抑制其增殖,且其抑制作用呈现浓度-时间依赖关系(p<0.05);gkn2抑制gcscs的ic50值约为30mg/l;gkn2抑制作用强于5-fu与vp-16(p<0.05)。5、肿瘤克隆球形成实验表明,gkn2处理组克隆球形成数目(15.1±0.45)明显少于未处理组(38.6±0.62)和不含gkn2的对照组(38.0±0.44),且克隆球直径较其小、透光度较其高(p<0.05),提示gkn2对gcscs克隆球的形成具有显著抑制作用。6、transwell迁移实验发现,gkn2处理组(69±3)迁移细胞数目明显低于未处理组(174±6)和不含GKN2的对照组(173±7)(P<0.05);Transwell侵袭实验显示,GKN2处理组(36±6)穿过基质胶转移至下室的细胞数目明显低于未处理组(94±12)和不含GKN2的对照组(93±9)(P<0.05)。以上结果表明GKN2可明显抑制GCSCs的迁移侵袭能力。7、流式细胞术检测结果显示,GKN2处理组CD44(+)SGC7901细胞周期与未处理组和不含GKN2的对照组相比,S期细胞比率明显降低(P<0.05),且增殖指数也降低(P<0.05),而G0/G1期细胞比率明显增高(P<0.05),表明GKN2可抑制CD44(+)SGC7901细胞增殖并阻滞细胞于G0/G1期;GKN2处理组细胞凋亡率(15.540±0.530)明显高于未处理组(8.083±0.480)和不含GKN2的对照组(7.543±0.471)(P<0.05),说明GKN2可促进GCSCs的凋亡。结论GKN2可诱导胃癌干细胞增殖抑制与凋亡,阻滞细胞于G0/G1期,并可抑制其迁移和侵袭能力。